基于金屬納米材料的新型傳感技術(shù)研究.pdf

1、生物傳感器具有靈敏度高、響應(yīng)速度快、選擇性好，一般不需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，它的出現(xiàn)和發(fā)展為生命科學(xué)研究提供了一種新的手段和技術(shù)支持，極大地推動(dòng)生命科學(xué)研究的發(fā)展，也日益得到了科研工作者的重視。近年來新興的納米材料由于其具有獨(dú)特的物理、化學(xué)性質(zhì)而受到人們的廣泛關(guān)注。本研究論文將納米金、銀納米簇等納米材料與熒光和化學(xué)生物傳感技術(shù)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合，開發(fā)和建立了一些熒光和電化學(xué)檢測(cè)新方法用于多核苷酸激酶、微球菌酶、膽固醇等

2、與生命活動(dòng)緊密相關(guān)的物質(zhì)的檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法相比，本論文所建立的方法靈敏度高，選擇性好，具體研究?jī)?nèi)容如下：
　?。?）基于λ外切酶對(duì)磷酸化DNA的降解以及利用鏈霉親和素-金納米粒子復(fù)合物和堿性磷酸酶對(duì)電化學(xué)信號(hào)的放大作用，提出了一種檢測(cè)多聚核苷酸激酶（PNK）活性的雙重信號(hào)放大的電化學(xué)方法（第2章）。當(dāng)體系中存在PNK時(shí)，固定于電極表面的PNK底物探針的5'末端將會(huì)被磷酸化。當(dāng)?shù)孜锾结樅团c之完全互補(bǔ)的生物素化的檢測(cè)探針雜交后，底物探

3、針將會(huì)被λ外切酶降解，使得檢測(cè)探針從電極表面解離下來，鏈霉親和素-金納米粒子和生物素化的堿性磷酸酶不能與之結(jié)合，從而引起電化學(xué)信號(hào)降低。當(dāng)PNK的濃度在0.01U/mL至5U/mL范圍內(nèi)時(shí)，電化學(xué)信號(hào)與 PNK濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，其檢測(cè)限為0.01U/mL。同時(shí)，也對(duì)硫酸銨對(duì)PNK酶活性的抑制作用進(jìn)行了研究。
　?。?）基于λ外切酶對(duì)磷酸化末端的特異性降解和DNA酶對(duì)底物DNA的切割及其循環(huán)作用，建立了一種檢測(cè)PNK酶活性的新方

4、法（第3章）。當(dāng)體系中存在PNK時(shí)，C-DNA的5′羥基將會(huì)被磷酸化，與互補(bǔ)序列E-DNA雜交成雙鏈后將被λ外切酶識(shí)別并降解，使得E-DNA從雙鏈中得以釋放出來，在Mg2+的共同作用下，使得DNA酶被激活，識(shí)別并切割底物信標(biāo)，使得信標(biāo)分子上熒光基團(tuán)的熒光信號(hào)得以恢復(fù)。同時(shí)，E-DNA將得以釋放，將與新的MB分子雜交，引發(fā)下一輪的催化切割，使得體系的熒光信號(hào)得到放大。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，檢測(cè)PNK的線性范圍為0.5-100 U/mL，檢測(cè)限

5、為0.16 U/mL。該實(shí)驗(yàn)方法為PNK酶活性檢測(cè)提供了一種新的方法。
　　（3）基于過氧化氫對(duì)銀納米簇?zé)晒獾拟?，建立了一種新的檢測(cè)膽固醇含量的熒光方法（第4章）。首先在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，對(duì)合成銀納米簇的DNA模板分子進(jìn)行了優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)在原模板分子的3'末端加上1-2個(gè)G堿基時(shí)，熒光將顯著增強(qiáng)，其最大發(fā)射波長(zhǎng)為605 nm。同時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)過氧化氫的存在能顯著猝滅銀納米簇的熒光。基于此原理，用優(yōu)化后的模板合成的銀納米簇作

6、為熒光指示劑測(cè)定了膽固醇的含量。當(dāng)膽固醇的濃度在0.2至200μM范圍內(nèi)時(shí)，熒光強(qiáng)度與膽固醇濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性相關(guān)系數(shù)為R=0.9943，檢測(cè)限為0.15μM，該方法操作簡(jiǎn)單，靈敏，并具有良好的選擇性，該方法也有望用于其他的在氧化過程中能產(chǎn)生過氧化氫的物質(zhì)的檢測(cè)。
　?。?）基于微球菌酶（MNase）對(duì)銀納米簇模板DNA的降解，建立了一種新的高靈敏，高選擇性的非標(biāo)記的熒光方法用于檢測(cè)MNase活性（第5章）。實(shí)

7、驗(yàn)中所用的單鏈DNA為MNase的底物，同時(shí)也是合成銀納米簇的模板。當(dāng)體系中存在MNase時(shí)，單鏈DNA將被降解，從而合成的AgNCs的量隨之減少，得到降低的熒光信號(hào)。當(dāng)MNase的濃度在1×10-5 U/mL至2×10-4 U/mL的范圍內(nèi)時(shí)，AgNCs熒光強(qiáng)度與MNase濃度呈線性相關(guān)，檢測(cè)限為8×10-6 U/mL。該方法在均相中進(jìn)行，無需對(duì)DNA鏈進(jìn)行標(biāo)記或者修飾，無需分離，簡(jiǎn)單，靈敏，快速，選擇性高，同時(shí)該方法也可用于其它酶的

8、檢測(cè)。
　　（5）基于聚合酶延伸和借助鏈霉親和素-金納米粒子（SA-AuNPs）復(fù)合物和堿性磷酸酶實(shí)現(xiàn)的兩步信號(hào)放大作用，提出了一種測(cè)定microRNA(miRNA)的電化學(xué)新方法（第6章）。目標(biāo)miRNA與固定于電極表面的DNA模板雜交，在DNA聚合酶和dNTPs的存在下，miRNA作為引物將沿著DNA模板進(jìn)行延伸。在延伸的過程中，由于biotin-11-dUTP的使用，生物素基團(tuán)將被引入延伸產(chǎn)物當(dāng)中。因此，利用SA-AuNPs

9、的橋梁作用，生物素化的堿性磷酸酶（biotin-ALP）將與延伸產(chǎn)物上的生物素結(jié)合，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)miRNA的濃度在1 pM到10 nM范圍內(nèi)時(shí)，電化學(xué)信號(hào)與miRNA的濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其檢測(cè)限為0.9 pM。該方法具有很高的選擇性，當(dāng)目標(biāo)RNA與其他RNA只存在一個(gè)堿基的差別時(shí)，該傳感裝置亦能對(duì)其進(jìn)行區(qū)分。正是由于該傳感器所具有的優(yōu)異性能，使得該裝置作為一種重要的檢測(cè) RNA的方法用于生物醫(yī)學(xué)研究和醫(yī)療診斷等領(lǐng)

10、域。
　?。?）基于磁性納米粒子良好的分離富集作用和SYBR Green I嵌入雙鏈DNA后熒光增強(qiáng)的性質(zhì)，建立了一種新的測(cè)定生物素的熒光方法（第7章）。體系中的生物素與生物素修飾的DNA競(jìng)爭(zhēng)與磁性納米粒子上的鏈霉親和素結(jié)合。經(jīng)磁性分離后，未結(jié)合的雙鏈DNA將被洗去，隨后加入的SYBR Green I染料將嵌入被磁性納米粒子捕獲的雙鏈DNA中，產(chǎn)生熒光信號(hào)。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分析體系在532 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨著生物素濃度的增