Cytophaga hutchinsoni纖維素酶系研究.pdf

1、Cytophaga hutchinsonii是廣泛分布于土壤中屬擬桿菌門(mén)的革蘭氏陰性細(xì)菌，具有很強(qiáng)的纖維素降解能力，在貧瘠條件下可以快速?gòu)氐椎亟到饨Y(jié)晶纖維素。C.hutchinsonii沒(méi)有游離的纖維素酶產(chǎn)生，其纖維素酶都是細(xì)胞結(jié)合型的，而且在纖維素降解過(guò)程中也沒(méi)有胞外還原糖的積累?；蚪M序列分析顯示C.hutchinsonii也不含編碼錨定蛋白或粘附蛋白的基因，而這兩者是纖維小體的重要組成。因此，C.hutchinsonii對(duì)纖維素的

2、降解既不采取好氧真菌的游離纖維素酶機(jī)制也不采取厭氧細(xì)菌的纖維小體機(jī)制，可能采用一種新型并且未知的纖維素降解機(jī)制。對(duì)這種纖維素降解機(jī)制的研究可能會(huì)對(duì)實(shí)現(xiàn)纖維素的生物轉(zhuǎn)化有一定幫助。而目前為止對(duì)C.hutchinsonii的纖維素降解機(jī)制了解甚少，其纖維素降解酶大部分也是未知的。通過(guò)基因組分析知道C.hutchinsonii中不含編碼已知纖維素外切酶的基因，其纖維素酶編碼基因中也不含碳水化合物結(jié)構(gòu)域(cabohydratebinding m

3、odule，CBM)。因而對(duì)C.hutchinsonii纖維素酶的研究顯得尤為重要，不僅可以幫助了解這種新型的纖維素降解機(jī)制，還有可能幫助發(fā)現(xiàn)一些新型的纖維素酶，擴(kuò)大工業(yè)用纖維素酶的來(lái)源。
　　本文將C.hutchinsonii中預(yù)測(cè)的多個(gè)纖維素酶在Escherichia.coli中進(jìn)行了表達(dá)，對(duì)得到活性表達(dá)的蛋白進(jìn)行了性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)三個(gè)新型的纖維素酶。具體研究?jī)?nèi)容以及取得的結(jié)果如下:
　　1.持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶CHU210

4、3的研究
　　持續(xù)性纖維素酶一般包括外切纖維素酶和持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶，可以持續(xù)降解纖維素鏈產(chǎn)生纖維二糖或纖維寡糖，在結(jié)晶纖維素降解過(guò)程中起重要作用。C.hutchinsonii基因組分析發(fā)現(xiàn)不含編碼已知外切纖維素酶的基因，但有兩個(gè)內(nèi)切纖維素酶（CHU_1107和CHU_2103）與已知的持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶相似性比較高，其中CHU_2103由346個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)糖苷水解酶家族5(Glycoside hydrolase，G

5、H5)的保守結(jié)構(gòu)域，而且與其他GH5家族持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶不同，CHU_2103不含有CBM。
　　在E.coli中表達(dá)CHU_2103，得到有活性的蛋白，對(duì)其性質(zhì)研究當(dāng)發(fā)現(xiàn)，CHU_2103不僅可以降解羧甲基纖維素(CMC)，還可以降解對(duì)硝基苯纖維二糖苷(pNPC)和纖維三糖，而pNPC和纖維三糖一般是外切纖維素酶的底物，不能被內(nèi)切纖維素酶降解，說(shuō)明CHU_2103兼具內(nèi)切纖維素酶和外切纖維素酶活性。CHU_2103降解不溶性纖

6、維素的最終產(chǎn)物是纖維二糖和纖維三糖，并且產(chǎn)生的還原端中約80％來(lái)自于可溶性組分，顯示CHU_2103可以持續(xù)降解纖維素鏈產(chǎn)生更多的可溶性還原糖。在降解CMC過(guò)程中，CHU_2103可以在短時(shí)間內(nèi)大幅降低CMC溶液的黏度，并且反應(yīng)的最終產(chǎn)物是一系列聚合度不同的纖維寡糖，說(shuō)明以內(nèi)切方式降解CMC，結(jié)合對(duì)不溶性纖維素的降解方式，判斷CHU_2103是持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶。CHU_2103降解纖維寡糖時(shí)終產(chǎn)物中葡萄糖的含量極少，而且在降解pNP-

7、纖維寡糖過(guò)程中有更大聚合度的纖維寡糖產(chǎn)生，說(shuō)明CHU_2103不僅具水解酶活性，也具有轉(zhuǎn)糖基酶活性，可以通過(guò)轉(zhuǎn)糖基作用生成更長(zhǎng)鏈的寡糖。
　　與已報(bào)道的持續(xù)性纖維素酶不同，CHU_2103只含有一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域(CD)，不含碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBM)，而且CHU_2103可以吸附纖維素，說(shuō)明其纖維素吸附能力存在于催化結(jié)構(gòu)域。對(duì)其催化結(jié)構(gòu)域活性位點(diǎn)附近保守氨基酸定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)197位色氨酸是CHU_2103保持持續(xù)性降解和纖維素吸

8、附能力的關(guān)鍵位點(diǎn)，將W197突變?yōu)楸彼岷驝HU_2103不能吸附纖維素也失去了持續(xù)降解的能力，變?yōu)榈湫偷膬?nèi)切纖維素酶。
　　在C.hutchinsonii中通過(guò)同源雙交換將chu_2103基因敲除后，其在纖維素為唯一碳源培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)幾乎不受影響，而對(duì)其細(xì)胞表面和細(xì)胞裂解液內(nèi)切纖維素酶活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)chu_2103敲除株的活性分別降低35％和25％，說(shuō)明CHU_2103是C.hutchinsonii細(xì)胞表面重要的內(nèi)切纖維素酶但并不是

9、其降解纖維素過(guò)程中關(guān)鍵或必需的纖維素酶。
　　2.Ca2+依賴的持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶CHU_1280的研究
　　CHU_1280由571個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)GH9家族保守結(jié)構(gòu)域，不含CBM，與Clostridium.thermocellum中一個(gè)外切纖維素酶具有較高的相似性，其序列一致性可達(dá)29％。CHU_1280的三維結(jié)構(gòu)與C.thermocellum中CelD相似性極大，并含有兩個(gè)保守的Ca2+結(jié)合位點(diǎn)。在E.col

10、i中表達(dá)CHU_1280并得到大量有活性的蛋白，對(duì)其性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)CHU_1280在不含Ca2+體系中不表現(xiàn)出任何活性，而在反應(yīng)體系中加入一定濃度CaCl2后既可以降解CMC也可以降解pNPC，說(shuō)明其活性是Ca2+依賴的。
　　CHU_1280降解CMC過(guò)程中可以迅速降低CMC溶液的黏度，最終產(chǎn)物為一系列聚合度不同的纖維寡糖，而降解不溶性纖維素的最終產(chǎn)物為葡萄糖和纖維二糖，并且產(chǎn)生的還原端中近80％來(lái)自于可溶性組分，說(shuō)明CHU_12

11、80以內(nèi)切方式降解CMC并且可以持續(xù)降解不溶性纖維素，屬于持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶。
　　CHU_1280對(duì)纖維三糖、纖維四糖以及纖維五糖等纖維寡糖也具有降解能力，降解纖維三糖的主要產(chǎn)物是葡萄糖和纖維二糖，降解纖維四糖的主要產(chǎn)物是纖維二糖還有少量的葡萄糖和纖維三糖，降解纖維五糖的主要產(chǎn)物是纖維二糖和纖維三糖還有少量葡糖糖和纖維四糖，說(shuō)明CHU_1280更傾向于降解糖鏈內(nèi)部的糖苷鍵，也可以從非還原端切下少量的葡萄糖。
　　CHU_1

12、280中不舍CBM，但發(fā)現(xiàn)其可以吸附纖維素，而且對(duì)纖維素的吸附性也是Ca2+依賴，說(shuō)明Ca2+可以改變CHU_1280的結(jié)構(gòu)，使其具有吸附并且降解纖維素的能力。
　　一般認(rèn)為現(xiàn)Ca2+促進(jìn)纖維素酶活力是通過(guò)增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性使其活力增大，但通過(guò)對(duì)CHU_1280穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以酶活性作為表征時(shí)，Ca2+可以使CHU_1280的耐熱性提高10℃左右(處理時(shí)間為1 h)，而以蛋白微熱量變化為表征時(shí)，則發(fā)現(xiàn)Ca2+使其整體蛋白結(jié)構(gòu)趨于不穩(wěn)

13、定。說(shuō)明Ca2+可以穩(wěn)定CHU_1280活性中心的結(jié)構(gòu)而使其整體結(jié)構(gòu)更加不穩(wěn)定。
　　3.纖維寡糖酶CHU_2268的研究CHU_2268由758個(gè)氨基酸殘基組成，含有一個(gè)GH3保守結(jié)構(gòu)域，NCBI中注釋為GH3家族的β-葡萄糖苷酶。CHU_2268的三維結(jié)構(gòu)與來(lái)自大麥的外切水解酶ExoⅠ和來(lái)自南極菌Psedoalteromonas的外切β-1，3/1，4-葡聚糖酶Exo P相似度比較高，相似性都在30％以上。SignalP預(yù)測(cè)C

14、HU2268不含信號(hào)肽序列但將其在E.coli中進(jìn)行表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)前26個(gè)氨基酸殘基為疏水區(qū)域，可能為其信號(hào)肽序列。
　　在E.coli中表達(dá)得到活性蛋白并進(jìn)行性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)CHU_2268不僅可以降解對(duì)硝基苯葡萄糖苷(pNPG)還可以降解pNPC，最終產(chǎn)物都是對(duì)硝基苯酚(pNP)和葡萄糖。在CHU_2268降解pNPC時(shí)，中間產(chǎn)物為pNPG和葡萄糖，說(shuō)明CHU_2268以外切方式從非還原端逐個(gè)切下葡萄糖。
　　CHU_2268

15、還可以降解纖維二糖和纖維寡糖等，最終產(chǎn)物都是葡萄糖，而且對(duì)各種寡糖底物的Km值相近，說(shuō)明其最適底物為纖維二糖和纖維寡糖，為纖維寡糖酶。對(duì)CHU_2268降解纖維寡糖中間產(chǎn)物檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)纖維寡糖的降解也是逐個(gè)切下葡萄糖，為外切方式。并且發(fā)現(xiàn)降解過(guò)程中有較長(zhǎng)鏈的寡糖產(chǎn)生，說(shuō)明CHU_2268為具有轉(zhuǎn)糖基活性的纖維寡糖酶。
　　CHU_2268可以與內(nèi)切纖維素酶協(xié)同降解纖維素產(chǎn)生葡萄糖，并且與內(nèi)切纖維素酶的協(xié)同作用遠(yuǎn)大于β-葡萄糖苷酶

16、與內(nèi)切纖維素酶的協(xié)同作用，可能在C.hutchinsonii纖維素降解過(guò)程中起重要作用。
　　4.利用Blue-native PAGE探究C.hutchinsonii膜上的蛋白復(fù)合體
　　C.hutchinsonii細(xì)胞膜上具有不同種類的纖維素酶，但這些纖維素酶各自單獨(dú)起作用還是以復(fù)合體形式共同作用于纖維素目前還不清楚，對(duì)C.hutchinsonii膜上與纖維素酶相互作用蛋白的研究或許可以幫助回答這個(gè)問(wèn)題。
　　Blu

17、e-native PAGE(BN-PAGE)是最初是為研究線粒體膜蛋白和蛋白復(fù)合體而建立的一種非變性電泳方法，這種方法在分離蛋白復(fù)合體的時(shí)候可以保持其生物學(xué)活性，可以用于蛋白與蛋白間相互作用以及膠內(nèi)活性檢測(cè)等方面的研究。將BN-PAGE與SDS-PAGE、活性染色以及蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)合，對(duì)膜上的三個(gè)蛋白復(fù)合體進(jìn)行了初步鑒定，它們可能分別與葡萄糖代謝以及寡肽的運(yùn)輸利用相關(guān)。而且發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii膜上有三個(gè)β-葡萄糖苷酶活性條帶

18、，其中一個(gè)β-葡萄糖苷酶可能以復(fù)合體形式存在，SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)里面含有六種不同的蛋白，這些蛋白有待于進(jìn)一步的質(zhì)譜鑒定和研究。
　　通過(guò)以上研究，對(duì)C.hutchinsonii的纖維素酶系有了較為深入地了解。研究發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii不依賴外切纖維素酶，而是通過(guò)內(nèi)切纖維素酶、持續(xù)性內(nèi)切纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和纖維寡糖酶的協(xié)同作用完成對(duì)纖維素的降解。對(duì)C.hutchinsonii的纖維素酶系的研究為揭示其獨(dú)特的纖維素降