血清骨保護素(OPG)對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎激素療效預(yù)測價值的研究.pdf

1、背景：隨著重度潰瘍性結(jié)腸炎(severe ulcerative colitis,SUC)發(fā)病率與病死率的不斷攀升，以及其發(fā)病急、進展快的特點，SUC已逐漸成為臨床關(guān)注的重點。糖皮質(zhì)激素是目前公認治療SUC的最主要藥物，但不同的患者對激素治療有著不同的臨床藥物反應(yīng)，部分患者存在激素抵抗。據(jù)有關(guān)報道顯示糖皮質(zhì)激素治療總有效率為70％，約30%的SUC達不到臨床緩解，存在糖皮質(zhì)激素抵抗現(xiàn)象。對于激素抵抗患者往往需要進行藥物升級療法，甚至需要手

2、術(shù)治療，若能提前預(yù)測患者對激素的敏感程度則能為臨床醫(yī)生選擇不同的治療方案提供幫助。目前尚缺乏一種可靠的標(biāo)準(zhǔn)提前預(yù)知患者對激素治療的敏感程度，研究顯示機體對糖皮質(zhì)激素敏感與否與異常增多的糖皮質(zhì)激素受體-β（GR-β）以及與NF-KB信號通路的活性增強有關(guān)。骨保護素（osteoprotegerin，OPG）是一種受體蛋白，近年來有學(xué)者提出OPG能反應(yīng)炎癥性腸病病變程度、部位、類型,并能預(yù)測UC患兒對糖皮質(zhì)激素的敏感性，有望成為協(xié)助炎癥性腸病

3、診療的新指標(biāo)。
　　目的：通過檢測SD大鼠SUC模型激素治療前后血清中OPG水平的變化以及結(jié)腸組織GR-β基因和NF-KB蛋白的表達，從而探討OPG能否作為預(yù)測SD大鼠結(jié)腸炎對激素敏感性的檢測指標(biāo)。
　　方法：60只質(zhì)量約250-280g的雄性SD大鼠；隨機編號為1-60號，采用單籠飼養(yǎng)。TNBS組為1-40號，模型組（M組）為41-50號，對照組（N組）為51-60號。TNBS組和M組均采用5%TNBS+50%乙醇（v/v

4、）溶液建立大鼠急性結(jié)腸炎的重癥模型，N組采用同等容量的50%的乙醇溶液灌腸。造模成功后的第三天予以干預(yù)處理，TNBS組大鼠每日于同一時間予以地塞米松磷酸鈉(2mg/kg)腹腔注射1次，共注射10天；M組、N組大鼠按相同計算方法予以腹腔注射生理鹽水。每日對大鼠的疾病活動指數(shù)（DAI指數(shù)）進行評分，分別于造模成功后第3天與第13天取大鼠眼眶靜脈血用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢查血清中OPG水平。第13天處死所有大鼠，采集結(jié)腸標(biāo)本行肉眼觀結(jié)腸病

5、變損害程度（CMDI）評分；取病變結(jié)腸組織行HE染色后觀察并行病理評分（TDI評分）。據(jù)DAI指數(shù)變化、TDI以及CDMI評分綜合結(jié)果將TNBS組分為激素有效組（S組）以及激素?zé)o效組（I組）。取病變明顯的結(jié)腸組織，用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）方法檢測N、M、S、I組結(jié)腸組織中的GR-β受體基因表達情況，蛋白NF-KB p65含量的檢測由蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）完成；激素治療前后OPG變化采用配對t檢驗完成，GR

6、-β與NF-KB p65分別采用單因素方差分析完成。
　　結(jié)果：
　　1、N組結(jié)腸組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)清楚，無炎性細胞浸潤，其DAI指數(shù)、CDMI及TDI結(jié)果均比其他各組得分低，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；M組DAI指數(shù)、CDMI及TDI評分均最高，大鼠可見不同程度的精神、食欲下降、腹瀉以及血便，肉眼可見腸粘膜的水腫和壞死，HE染色可見結(jié)腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞以及炎性細胞的浸潤，杯狀細胞減少，表明潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型復(fù)制成功。

7、>　　2、ELISA結(jié)果：（+表示造模第3天時的血清標(biāo)本，-表示造模第13天的血清標(biāo)本）OPG含量在N組最低，M組第3天時的OPG（M+）明顯高于其他各組。S組激素治療后（S-）的OPG含量明顯低于治療前（S+）（p＜0.01），然而I組激素治療前（I+）和治療后（I-），N組第3天（N+）和第13天（N-）的OPG含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。
　　3、GR-β受體基因表達結(jié)果：I組中的GR-β受體基因表達量顯著高于其他

8、各組,GR-β表達量在N組最低。除N組與S組之間無差異（p＞0.05）外，其余各組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。其中，GR-β基因在I組的表達量明顯高于S組。
　　4、NF-KB p65蛋白表達量：M組NF-KB p65蛋白表達最多，N組最少；且I、S、M、N任意兩組之間比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）。其中I組蛋白表達量遠遠高于S組（p＜0.01）。
　　5、ROC曲線分析OPG最佳截斷值為1542.9360

9、pg/ml，ROC曲線下面積為0.910；GR-βROC曲線下面積為0.944，NF-KB p65 ROC曲線下面積為0.891。
　　結(jié)論：
　　1、三硝基苯磺酸溶液灌腸法是建立潰瘍性結(jié)腸炎動物模型較為理想的方法，當(dāng)TNBS劑量為180mg/kg時所得到的SD大鼠結(jié)腸炎模型可達到重癥標(biāo)準(zhǔn)。
　　2、本實驗驗證了GR-β受體以及NF-KB p65可以間接預(yù)測大鼠對糖皮質(zhì)激素的敏感程度。
　　3、UC大鼠的血清OP