傣藥資源品種整理與分子鑒定.pdf

1、傣藥是我國(guó)四大民族藥之一，是我國(guó)民族醫(yī)藥的重要組成部分。由于受自然、歷史條件以及歷代傣醫(yī)藥本草文獻(xiàn)記載不詳?shù)扔绊?，傣藥材的同名異物、同物異名現(xiàn)象普遍存在，造成了傣藥的品種不清和使用混亂。為了澄清傣藥資源的品種情況，建立傣藥材鑒定體系，為推進(jìn)傣藥材的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程提供科學(xué)參考。本文采用文獻(xiàn)分析法、民族植物學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)傣藥材開(kāi)展了系統(tǒng)整理研究。在此基礎(chǔ)上，采用數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建和DNA條形碼技術(shù)，建立了傣藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)；并探索了DNA

2、條形碼技術(shù)和高分辨熔解曲線技術(shù)，以及二者結(jié)合在傣藥材鑒定和市場(chǎng)監(jiān)管中的應(yīng)用。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1．本研究收集整理了前人近40年的研究成果，引用專著35本，期刊文獻(xiàn)143篇，采用專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)查詢驗(yàn)證，共收集到傣醫(yī)學(xué)藥物信息8590條。去除無(wú)拉丁名或拉丁名無(wú)法確認(rèn)的藥材信息97條，獲得傣藥材有效信息8493條。將上述物種拉丁名進(jìn)行同異名處理后，以接受名（Accept name）作為唯一字段，對(duì)目前傣醫(yī)學(xué)記載使用的1654種藥

3、物從從植/動(dòng)/礦物名、傣文名、科、藥材名、部位、拉丁名、功能主治、文獻(xiàn)來(lái)源、標(biāo)準(zhǔn)收載等進(jìn)行修訂，編制了傣族藥物資源編目信息集。
　　2．在上述研究基礎(chǔ)上，采用民族植物學(xué)研究方法和數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法對(duì)傣藥材資源種類、傳統(tǒng)利用特點(diǎn)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的整理和分析。結(jié)果表明：
　　2.1傣醫(yī)學(xué)使用的藥物種類豐富，目前已記載的使用的藥物共有1654種，其中植物藥1491種，分屬于191科，836屬，包括地衣類2科2屬4種，真菌類7科

4、9屬9種，苔蘚類1科1屬1種，藻類2科2屬2種，蕨類植物19科26屬42種，裸子植物7科7屬13種，被子植物153科789屬1420種；動(dòng)物藥141種，分屬于90科123屬；礦物藥22種。在傣醫(yī)使用1491種傣藥植物中，為我國(guó)特有分布的藥用植物有159種，分屬于70科133屬；被列入瀕危珍稀名錄保護(hù)的有152種，分屬62科133屬；動(dòng)物藥中，列入保護(hù)的珍稀瀕危動(dòng)物種數(shù)有68種，占動(dòng)物類傣藥總數(shù)的48.22％。
　　2.2從使用特點(diǎn)

5、來(lái)看，傣族植物藥的藥用部位以根及根莖類入藥頻次最高，其次為全草類和葉類。主治疾病方面，植物藥中主治疾病最多的是消化系統(tǒng)疾病，其次分別是針對(duì)各種體征、損傷、循環(huán)系統(tǒng)、皮膚、呼吸以及泌尿系統(tǒng)等疾病；動(dòng)物藥則以皮膚、體征和循環(huán)系統(tǒng)疾病為最多，其次是消化系統(tǒng)和傳染??；礦物藥主要為皮膚和循環(huán)系統(tǒng)疾病。從使用方法來(lái)看，植物藥以湯劑用法最多，其次是各種貼劑（外敷或外搽）；動(dòng)物藥多以粉劑形式使用，其次是貼劑；礦物藥則多為外用，以貼劑（涂抹敷患處）方式為

6、主。
　　2.3傣藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)整理結(jié)果表明，目前共有785個(gè)傣藥材被各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)收載，占傣藥材總數(shù)的47.46%，其中被《中華人民共和國(guó)藥典》收載的藥材品種有327個(gè)。以豆科和大戟科為例，從藥材名稱、品種和基原、部位、功效、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等方面的分析表明，目前傣藥材的―品種-名稱-基原‖不規(guī)范的情況普遍存在，在其藥用部位和功效表述上仍有待規(guī)范；傣藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)極不完善，阻礙了傣藥的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)傣藥的本草考證、資源與使用現(xiàn)狀調(diào)查，

7、并結(jié)合現(xiàn)代藥物研究技術(shù)開(kāi)展系統(tǒng)研究，推動(dòng)傣藥材的品種整理和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系建立工作。
　　3．采用試劑盒法提取傣藥材的基原植物總 DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增其ITS2序列或psbA-trnH序列并雙向測(cè)序。應(yīng)用CodonCode Aligner5.1.5對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行校對(duì)拼接，去除低質(zhì)量序列及引物區(qū)，獲得傣藥材ITS2序列或psbA-trnH序列，建立了300種常見(jiàn)傣藥材的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列；在此基礎(chǔ)上，基于課題組前期研究和數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)，結(jié)合分

8、析 GenBank序列，采用BLAST分析防錯(cuò)、系統(tǒng)樹(shù)分析防錯(cuò)等方法核驗(yàn)序列的可靠性，建立了傣藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，該庫(kù)由樣品數(shù)據(jù)庫(kù)、序列數(shù)據(jù)庫(kù)組成，包含1000余種傣藥材和大量混偽品及密切相關(guān)物種。
　　4．采用 DNA條形碼技術(shù)對(duì)“哈賓蒿”、“芽桿莊”、“芽靈捂”、“賀帕舉雷”4種傣藥材及其混偽品的鑒別進(jìn)行了研究，同時(shí)探討了高分辨熔解曲線技術(shù)在傣藥材鑒別中的應(yīng)用。結(jié)果表明DNA條形碼和高分辨熔解曲線技術(shù)可有效用于傣藥材及其

9、混偽品的鑒別，其操作易于流程化，標(biāo)準(zhǔn)化，為傣藥的臨床用藥安全和市場(chǎng)監(jiān)管提供了強(qiáng)有力的工具。
　　4.1基于大青屬（Clerodendrum）12種植物共48份樣品和GenBank下載序列，構(gòu)建大青屬ITS2和psbA-trnH條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)27份購(gòu)自市場(chǎng)的“哈賓蒿”藥材及飲片進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，ITS2序列種間最小變異大于種內(nèi)最大變異，而psbA-trnH序列種間最小變異則小于種內(nèi)最大變異。因此，ITS2序列作為條形

10、碼能穩(wěn)定、準(zhǔn)確鑒別“哈賓蒿”藥材及其混偽品。市場(chǎng)藥材調(diào)查研究表明，市售哈賓蒿基原物種來(lái)源復(fù)雜，27份藥材中僅有一份為C. japonicum(Thunb.) Sweet，應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)能對(duì)流通市場(chǎng)進(jìn)行有效監(jiān)管。
　　4.2基于重樓屬（Paris）及其易混品9種植物共30份實(shí)驗(yàn)樣本，構(gòu)建“芽桿莊”及其易混品的高分辨熔解曲線鑒別模型。應(yīng)用該模型對(duì)10份購(gòu)自市場(chǎng)的“芽桿莊”藥材進(jìn)行鑒定，全部藥材能夠歸屬到相應(yīng)的物種類群，進(jìn)一步的D

11、NA測(cè)序比對(duì)結(jié)果與高分辨熔解曲線分型一致，表明高分辨熔解曲線用于藥材市場(chǎng)流通監(jiān)管是可行的。
　　4.3基于耳草屬Hedyotis16個(gè)物種共70條ITS2序列構(gòu)建“芽靈捂”（H. diffusa Willd.）及近緣物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果表明基于ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以及比對(duì)法和最小距離法均能夠明顯區(qū)分耳草屬16個(gè)物種。應(yīng)用該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)市場(chǎng)收集的15份“芽靈捂”藥材進(jìn)行鑒定，比對(duì)結(jié)果顯示7份藥材與白花蛇舌草相似度最高，

12、聚為一支，3份藥材與纖花耳草具有高度相似性，聚為一支，余者為其他物種。而后根據(jù)DNA條形碼研究結(jié)果，選擇已知基原的“芽靈捂”（H. diffusa Willd.）及其混偽品，利用高分辨熔解曲線技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示高分辨熔解曲線能有效鑒別“芽靈捂”（H. diffusa Willd.）及其混偽品。
　　4.4基于ITS2序列，對(duì)42份收集于市場(chǎng)的賀帕舉雷（Saposhnikovia divaricata(Trucz.) Sch

13、ischk.）藥材進(jìn)行研究，結(jié)果表明，12份藥材與防風(fēng)相似度最高，15份與竹葉防風(fēng)相似度最高，5份與杏葉防風(fēng)相似度最高， 8份與華山前胡相似度最高，1份與葛縷子相似度最高，1份與白花前胡相似度最高。基于ITS2序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育NJ樹(shù)以及比對(duì)法（BLASTl）和最小距離法（Nearest distance）均能夠明顯區(qū)分上述六個(gè)物種。利用高分辨熔解曲線技術(shù)對(duì)4種已知基原的“賀帕舉雷”及其混偽品藥材進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示高分辨熔解曲

14、線能有效鑒別“賀帕舉雷”及其混偽品。本研究表明市售賀帕舉雷（S. divaricata(Trucz.) Schischk.）藥材基原物種來(lái)源復(fù)雜，應(yīng)用DNA條形碼分子鑒定法和高分辨熔解曲線法能夠?qū)λ幉牧魍ㄊ袌?chǎng)進(jìn)行有效監(jiān)管。
　　綜上所述，本研究系統(tǒng)地對(duì)傣藥材資源品種進(jìn)行了整理，首次澄清了傣藥材的資源品種情況。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了傣藥材DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)，并建立了300種常用傣藥材DNA標(biāo)準(zhǔn)序列。同時(shí)將DNA條形碼以及結(jié)合高分辨熔解曲