廣西β地中海貧血胚胎植入前遺傳學診斷技術(shù)平臺建立及臨床應(yīng)用研究.pdf

1、第一部分、廣西人群β珠蛋白基因15個STR基因座的遺傳多態(tài)性研究
　　目的：研究與β珠蛋白（β-globin，HBB）基因緊密連鎖的15個短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)基因座在廣西人群中的遺傳多態(tài)性，為建立β地中海貧血胚胎植入前遺傳學診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)的單體型分析技術(shù)(preimplantation genetic haplotypi

2、ng，PGH)提供實驗依據(jù)。
　　方法：采集廣西地區(qū)150名無關(guān)個體的外周靜脈血，提取外周血基因組DNA，通過熒光PCR技術(shù)擴增與β珠蛋白基因緊密連鎖(距離HBB基因＜1Mb)的15個STR基因座(HBB4506、D11 S988、HBB4677、D11 S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D

3、11S1338），擴增產(chǎn)物使用ABI3500Dx遺傳分析儀進行毛細管電泳，結(jié)果用Genemaper4.1軟件進行分析。最后利用Microsoft Excel軟件計算15個HBB-STR基因座的等位基因頻率分布以及多態(tài)信息量(polymorphism information content，PIC)等。
　　結(jié)果：在這15個HBB-STR基因座（HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11

4、S1243、HBB5138、HBB5178、 HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338)上分別檢出18、24、22、11、18、27、13、13、16、23、22、16、17、18和7個等位基因，等位基因頻率從0.003333到0.383333不等。這15個HBB-STR基因座的多態(tài)信息量(PIC)分別為0.8457、0.8983、0.8931、0.7592、0.

5、8698、0.9046、0.7940、0.7925、0.7708、0.9102、0.8583、0.8467、0.7438、0.8366和0.7704。這15個基因座的PIC均＞0.7000，平均值為0.8329，其中PIC＞0.8500的HBB-STR基因座有6個。
　　結(jié)論：本研究檢測的這15個HBB-STR基因座在廣西人群中的多態(tài)信息量(PIC)較高，具有高度的遺傳多態(tài)性，在建立β地中海貧血胚胎植入前遺傳學診斷(PGD)的單體

6、型分析(PGH)技術(shù)中具有較高的應(yīng)用價值，為后續(xù)工作的開展提供了實驗依據(jù)。
　　第二部分、β地中海貧血胚胎植入前遺傳學診斷中不同診斷方法的比較
　　目的：對β地貧PGD中兩種遺傳學診斷方法——反向點雜交(reverse dotblot，RDB)結(jié)合STR單體型分析技術(shù)與二代測序(Next generationsequencing，NGS)技術(shù)，從診斷時間、確診率、費用等方面進行對比研究，建立最適宜的遺傳學診斷技術(shù)應(yīng)用于廣西地

7、區(qū)β地貧PGD。
　　方法：
　　選擇雙方均為β地中海貧血基因突變攜帶者、有PGD指征且同意參加本研究的的夫婦?；颊叻驄D及另外三名家系成員（女方母親、男方母親和男方父親）一同抽取外周靜脈血進行15個STR位點的家系連鎖分析?；颊呓?jīng)過常規(guī)的藥物促排卵、取卵、取精、卵胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmicsperm injection，ICSI)、胚胎培養(yǎng)等程序，將所得胚胎全部進行囊胚培養(yǎng)，形成囊胚后，取囊胚期數(shù)個（

8、5-8個）滋養(yǎng)外胚層細胞活檢，活檢后即將所有囊胚行玻璃化冷凍。利用多重置換擴增(Multiple displacementamplification，MDA)法對滋養(yǎng)外胚層細胞進行全基因組擴增(Whole genomeamplification，WGA)。MDA擴增產(chǎn)物一部分采用反向點雜交(RDB)結(jié)合15個短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點的單體型分析(PGH)技術(shù)進行遺傳學診斷（A組）;另一部分MDA擴增產(chǎn)物采用二代測序(NGS)方法進行

9、診斷（B組）。比較兩種方法的檢出率、診斷符合率、所需時間和費用等。待診斷結(jié)果出來后選擇最合適的囊胚進行解凍移植。
　　結(jié)果：納入本研究的患者獲卵24個，胚胎13個，囊胚培養(yǎng)后形成6枚囊胚（囊胚評分分別為4BB，4BC，3CC，3CC，3BC，3CC），每個囊胚取滋養(yǎng)外胚層細胞活檢，6例樣本MDA法擴增均擴增成功，擴增成功率100％。A組中，囊胚1地貧基因型診斷結(jié)果為β-28/βCD41-42;囊胚2地貧基因型診斷結(jié)果為βCD41-

10、42/βN;囊胚3地貧基因型診斷結(jié)果為βN/βN;囊胚4的地貧基因型診斷結(jié)果為β-28/βN/βN;囊胚5和6的地貧基因型診斷結(jié)果均為β-28/βN。B組的地貧基因型診斷結(jié)果與A組完全一致，B組同時對囊胚2-6進行染色體拷貝數(shù)檢測，診斷出囊胚2為整倍體，囊胚3-6均為非整倍體。A組所需診斷時間為2-3天，結(jié)果分析所需時間約為1個工作日;B組所需診斷時間為2-3天，結(jié)果外送嘉寶仁和公司分析，所需時間為7個工作日。A組費用為2000元/囊胚

11、，而B組費用為3500元/囊胚。最后選擇囊胚2解凍移植，遺憾的是未獲得臨床妊娠。
　　結(jié)論：與二代測序(NGS)技術(shù)相比，反向點雜交結(jié)合STR單體型分析技術(shù)也能在β地中海貧血PGD中有效、準確地診斷出植入前囊胚的地貧基因型，能夠應(yīng)用于β地貧PGD臨床。雖然目前二代測序價格昂貴、結(jié)果分析人員要求高，臨床推廣應(yīng)用受限，但NGS是PGD遺傳學診斷技術(shù)的發(fā)展方向和未來趨勢。然而考慮到目前各方面條件的限制以及在廣西地區(qū)開展β地貧PGD的急切

12、需求，RDB結(jié)合15個STR位點單體型分析的診斷方法更加適合目前的廣西地區(qū)β地貧PGD，值得推廣應(yīng)用。
　　第三部分、MDA結(jié)合RDB及STR單體型分析在β地貧PGD中的臨床應(yīng)用研究
　　目的：研究多重置換擴增(MDA)結(jié)合反向點雜交(RDB)及短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)單體型分析技術(shù)在β地貧PGD中的臨床應(yīng)用。
　　方法：納入8對雙方均為β地中海貧血基因突變攜帶者且要求進行β地貧PGD治療的夫婦。攜帶者夫婦及其雙方父母

13、（每個家系一共6名成員）均抽取外周靜脈血進行15個STR位點的家系連鎖分析?；颊呓?jīng)過常規(guī)的藥物促排卵、取卵、取精、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)、胚胎培養(yǎng)等程序，將所得胚胎全部進行囊胚培養(yǎng)，形成囊胚后，取囊胚期數(shù)個（5-8個）滋養(yǎng)外胚層細胞活檢，活檢后即將所有囊胚進行玻璃化冷凍。利用多重置換擴增(MDA)法對取得的滋養(yǎng)外胚層細胞進行全基因組擴增(WGA)。MDA擴增產(chǎn)物采用反向點雜交(RDB)結(jié)合15個短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)位點的單體

14、型分析(PGH)技術(shù)進行遺傳學診斷。待診斷結(jié)果出來后，結(jié)合致病基因遺傳學診斷結(jié)果和囊胚評分，選擇最佳囊胚進行解凍移植，妊娠后孕18-22周通過羊水產(chǎn)前診斷進一步驗證PGD診斷結(jié)果。
　　結(jié)果：這8對夫婦，β地中海貧血基因突變類型分別為CD41-42/N、CD17/N、-28/N或IVS-Ⅱ-654/N。每個家系6名成員檢測15個STR位點后結(jié)果顯示每個家系均有7個或以上（HBB基因上游或下游均有2個以上）的STR位點可以提供診斷信

15、息，單體型構(gòu)建成功?；颊呓?jīng)過常規(guī)藥物促排卵，取卵、卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)后共獲得147枚胚胎，形成86枚囊胚，囊胚形成率58.50％。其中82枚囊胚擴增成功，擴增成功為95.35％。80枚囊胚獲得了明確診斷，其中24枚囊胚為正常純合子;38枚囊胚診斷為雜合子;18枚囊胚為不能移植的異常純合子或雙重雜合子。8例患者中一共4例患者進行了囊胚解凍移植（例1、例2、例3和例6），均為單囊胚移植。其中3例（例1、例2和例3）獲得妊娠，1例

16、（例6）未妊娠。妊娠率為75％(3/4)。例1和例2患者移植正常純合子囊胚（基因型βN/βN），中孕期羊水產(chǎn)前診斷結(jié)果與PGD診斷結(jié)果相符。例3患者移植雜合子囊胚(基因型為βCD41-42/βN)，移植后獲得妊娠，但目前還未行產(chǎn)前診斷驗證PGD診斷結(jié)果。
　　結(jié)論：本研究建立的β地貧PGD方法——即經(jīng)多重置換擴增(MDA)后，反向點雜交(RDB)結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)單體型連鎖分析，經(jīng)驗證有效、準確，可以在廣西地區(qū)β地貧PG