Purification, Characterization, and Determination of Antitumor Activity of a Novel Glucan from the Fruiting Bodies of Coriolus.pdf

1、蘑菇因其營養(yǎng)價值和烹飪價值而廣為人知，也被視為滋補珍品。近幾十年來，人類已經(jīng)把它當(dāng)作天然藥物使用。在許多亞洲國家,蘑菇被認(rèn)為是功能食品，它所帶來的健康價值超過傳統(tǒng)營養(yǎng)品。蘑菇屬于擔(dān)子菌綱，包含眾多種屬，大多數(shù)都有體積碩大的的子實體。癌癥是威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病。天然藥物與手術(shù)及化療相比更加安全，副作用也更少，因此天然藥物已成為具有治療癌癥前景的手段。
　　在本課題，我們報道一種高效的天然抗癌物質(zhì)葡聚糖(CVG)，該聚糖是從在中國

2、被稱為云芝的Coriolus vesicolor(CV)中提取得到的。在世界上，云芝是第二個種植食用的蘑菇，在全球市場中，也被廣泛應(yīng)用與中藥試劑中。它的重要性源于它的營養(yǎng)價值和醫(yī)藥應(yīng)用。從云芝中已分離出一些生物活性物質(zhì)，其中包括酚類化合物、麥角固醇、硒、香菇嘌呤、維生素以及鈣和礦物質(zhì)。葡聚糖也被稱為碳水化合物，屬于生物活性化合物，由葡萄糖分子組成，在海藻、真菌和酵母的細(xì)胞壁形成高度保守的結(jié)構(gòu)。葡聚糖已被作為一種生物活性化合物而成功用于治

3、療高危神經(jīng)母細(xì)胞瘤。此外，葡聚糖通過增加自然殺傷細(xì)胞和免疫球蛋白，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。某些葡聚糖具有降低膽固醇、促進骨髓細(xì)胞增殖、激活巨噬細(xì)胞,抗癌細(xì)胞的作用。最近，從子實體、菌絲和菌核中提取的葡聚糖顯示出具有較高的生物活性，如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗病毒、護肝、低膽甾醇血,低血糖等。
　　與以上研究不同，本研究的目的是探討從云芝子實體提取的葡聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性及構(gòu)效關(guān)系。通過利用熱水、80%乙醇(v/v)沉淀、Se

4、vag法脫蛋白成功地從云芝子實體中提取了粗多糖 CVG-0，占干材料總重量的10.8%。在 CVG-0凍融過程中，形成一種多相分散的膠狀多糖 CVG-1，經(jīng)凍干后，CVG-1在粗多糖CVG-0的總干重中達到30.38%。為了溶解 CVG-1葡聚糖，先利用2%氫氧化鈉溶解，再以50%醋酸中和。以10000 rpm離心20分鐘后，反復(fù)凍融上清液，以制備水溶性 CVG-S片段，在總干重中產(chǎn)率達到89.36%。隨后，利用多種層析技術(shù)對CVG-S

5、進一步提取和純化，應(yīng)用陰離子交換色譜和Sephacryl s–500凝膠過濾法， 對兩種片段的(CVG-S1,CVG-S2)進行收集。對這兩個片段利用Sephacryl s-500分析用凝膠柱進一步純化，得到單一產(chǎn)物(CVG)。CVG分子的均一性和分子量的分布通過裝備有 HPGPC及 GPCTSK-gel層析柱的G-3000 PWXL色譜儀檢測，結(jié)果顯示分子量為8.8 kDa。高效液相色譜分析表明，CVG分子主要由葡萄糖單糖組

6、成，比例高于90%（350.7摩爾比率）。除此之外，還有少量的D-Fuc，D-Ara，D-Man，and D-Gal組成，摩爾比分別為1.0/1.1/3.0/3.9。然而，應(yīng)用核磁共振,FT-IT,甲基化分析表明，CVG片段的主鏈由(1→6)-α-D-Glcp組成。
　　初步生物活性測試(細(xì)胞毒性試驗)顯示,CVG在不同濃度(4、10、20毫克/毫升)下表現(xiàn)出對肉瘤 S-180劑量依賴性的體外抗腫瘤活性，高濃度比低濃度更有效。此外

7、,這些葡聚糖對懸浮細(xì)胞(肉瘤-180)有更高的抑制活性。CVG濃度在20毫克/毫升時，對S-180細(xì)胞的抑制率為高達95%，然而，在4毫克/毫升和10毫克/毫升濃度下，則顯示抑制率分別為31%,和81%。
　　在昆明小鼠體內(nèi)肉瘤-180劑量實體瘤生長的長達9天的抗腫瘤活性檢測結(jié)果表明，CVG使用劑量在40、100和200毫克/公斤時，顯示的抑制率分別為64%,72%,和79%。相比之下,使用20毫克/公斤的環(huán)磷酰胺抑制增長約為84

8、%。雖然CVG的抗腫瘤活性低于環(huán)磷酰胺，但由于較為安全，CVG仍是首選。體內(nèi)生物檢測試驗表明,與陽性對照相比(P<0.05)，CVG明顯增加了脾細(xì)胞，這是因為CVG具有較高的免疫調(diào)節(jié)活性，增加了腫瘤小鼠胸腺和脾臟指數(shù)，增強了 T和 B淋巴細(xì)胞的增殖，加劇了腫瘤重量的降低。與模型組相比，CVG組巨噬細(xì)胞的吞噬作用顯著減弱，但略高于正常和陽性對照。同時，CVG提高了白細(xì)胞的免疫能力，使患腫瘤小鼠吞噬和抑制了 S-180細(xì)胞的生長。目前的研究

9、顯示,葡聚糖與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，可能會改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)信號的表達，阻止細(xì)胞周期和產(chǎn)生細(xì)胞凋亡,最終抑制腫瘤的生長。本研究表明，由于CVG的免疫調(diào)節(jié)活性，CVG將會成為一個有前途的抗腫瘤輔助治療劑。
　　本研究也評估了CVG對IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-17A，IFN,和IFN-γ的合成造成的影響。在CVG(200毫克/公斤)刺激下，與環(huán)磷酰胺(陽性組)相比，所有上述細(xì)胞因子的合成量顯著提高；與40毫克/公斤劑量相比