GFP標(biāo)記的hPMSCs對(duì)肝纖維化大鼠的治療潛能及初步機(jī)理研究.pdf

1、研究背景：
　　肝纖維化是一種常見的影響人類健康的慢性進(jìn)行性肝??；原位肝移植是目前公認(rèn)治療終末期肝病唯一有效的方法，但是由于供體器官來源困難、手術(shù)并發(fā)癥、免疫排斥、價(jià)格昂貴等原因限制了肝移植的臨床應(yīng)用。因此亟待尋找新的有效治療肝病的方法。近年來，隨著干細(xì)胞移植技術(shù)的興起，并且由于其來源豐富、創(chuàng)傷性小、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，有望成為肝病治療的新手段。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是中胚

2、層來源的一類成體多能干細(xì)胞，其除了具有能夠向中胚層和非中胚層細(xì)胞的多向分化潛能和高度自我更新能力，此外還具有靶向歸巢、免疫調(diào)節(jié)和主動(dòng)適應(yīng)并改造微環(huán)境等生物學(xué)特性，使MSCs能夠應(yīng)用于多種損傷組織的修復(fù)治療。胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來源的MSCs有相似的生物學(xué)特性，但又具有無倫理學(xué)限制、來源豐富、非侵入性易獲取、擴(kuò)增分化能力高、免疫抑制的特性等優(yōu)勢(shì)，可作為種子細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植。
　　研究目的：
　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的主要目的是采

3、用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein, GFP）標(biāo)記的人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（human placental mesenchymal stem cells,hPMSCs）移植入四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）誘發(fā)的肝纖維化大鼠模型，進(jìn)行體內(nèi)示蹤，療效評(píng)價(jià)，并進(jìn)行初步的機(jī)制探討。
　　研究方法：
　　選取本課題組凍存的第三代 hPMSCs，復(fù)蘇后繼續(xù)培養(yǎng)傳代至細(xì)胞達(dá)

4、到穩(wěn)定狀態(tài)，待融合度達(dá)到50-60％時(shí)利用慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，構(gòu)建表達(dá) GFP的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（GFP+hPMSCs）；六周齡的SD雄性大鼠，采用50%CCl4橄欖油溶液，按照0.5ml/100g皮下注射，每周2次，持續(xù)8周，建立大鼠肝纖維化模型；隨機(jī)選取五只造模大鼠做病理切片，檢測(cè)造模情況。大鼠隨機(jī)分為以下三組：GroupⅠ（生理鹽水對(duì)照組），造模時(shí)皮下注射生理鹽水替代四氯化碳，尾靜脈注射3-6代的GFP+hPMSCs，劑量為2.0×

5、106/1ml生理鹽水/只；GroupⅡ（GFP+hPMSCs移植治療組），造模成功后尾靜脈注射3-6代的GFP+hPMSCs，劑量為2.0×106/1ml生理鹽水/只；GroupⅢ（肝纖維化模型組），造模成功后尾靜脈不注射細(xì)胞只注射生理鹽水1ml/只。在GFP+hPMSCs移植后的1周、4周、8周和12周處死大鼠，取肝臟，收集血清；然后，采用H&E、Sirius red和Masson’s trichrome染色以及肝臟彈性成像技術(shù)進(jìn)行

6、大鼠肝纖維化程度判斷；并且，應(yīng)用血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè) ALB、ALT、AST、ALB、LN、HA，觀察 GFP+hPMSCs移植對(duì)大鼠肝功能的影響以及對(duì)肝纖維化的改善情況。
　　采用熒光成像技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色以及RT-PCR檢測(cè)ALB、AFP、CK18在大鼠肝組織中的表達(dá)，確定GFP+hPMSCs移植在大鼠肝臟中的定植及定向分化潛能；采用免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR方法檢測(cè)a-SMA、TGF-β1蛋白與mRNA在大鼠肝組織中

7、的表達(dá)，進(jìn)行初步機(jī)理研究。
　　研究結(jié)果：
　　本研究成功構(gòu)建了表達(dá)GFP的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；H&E、Sirius red和Masson’s trichrome染色結(jié)果顯示：CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型成功建立；與肝纖維化模型組相比，GFP+hPMSCs移植治療組纖維組織增生程度、肝臟纖維化評(píng)分、纖維組織的沉積量均明顯降低；肝臟彈性成像值表現(xiàn)了相似的結(jié)果， GFP+hPMSCs移植治療組中 Metavir評(píng)分明顯降低；血

8、清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：與肝纖維化模型組相比，GFP+hPMSCs移植治療組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）水平顯著降低；而白蛋白（ALB）的血清水平增加；GFP+hPMSCs移植治療組的層粘連蛋白（LN）和透明質(zhì)酸（HA）的血清水平均低于肝纖維化模型組。
　　肝臟熒光成像和免疫組織化學(xué)染色以及RT-PCR顯示：GFP+hPMSCs移植治療組中，在 GFP+hPMSCs移植后的4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均

9、檢測(cè)到熒光信號(hào)；在GFP+hPMSCs移植后1周，在任何肝臟樣品中均未觀察到AFP，ALB和CK18。然而，移植后4周、8周和12周，在大鼠所有肝組織中均檢測(cè)到AFP，ALB， CK18的表達(dá)，但表達(dá)量隨時(shí)間降低；免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR的結(jié)果顯示：與肝纖維化模型組相比，GFP+hPMSCs移植治療組中的a-SMA和TGF-β1表達(dá)水平顯著降低，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。
　　結(jié)論：GFP+hPMSCs移植能夠明顯緩解大鼠肝