Ad-HGF對(duì)大鼠肝纖維化的基因治療.pdf

1、肝纖維化是各種致病因子持續(xù)作用于肝臟所導(dǎo)致各種慢性肝病的共同結(jié)果，是一種受損肝細(xì)胞的修復(fù)性反應(yīng)。肝星狀細(xì)胞的活化被公認(rèn)為是各種慢性肝病最終向肝纖維化轉(zhuǎn)變的必要條件。同時(shí)，許多細(xì)胞因子參與到肝纖維化的過(guò)程中，其中以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)最為關(guān)鍵。TGF-βl可以促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化、細(xì)胞外基質(zhì)的沉積并抑制膠原纖維的降解。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)是一種具有促肝細(xì)胞有絲分裂、抑制肝細(xì)胞凋亡、抑制肝細(xì)胞炎癥等作用的多功能細(xì)胞

2、因子?？紤]到肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的缺乏可能與慢性肝病的發(fā)生息息相關(guān)，而肝纖維化又是各種慢性肝病的共同結(jié)果，因此認(rèn)為給予一定量的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可能是改善肝纖維化的一種嶄新的治療策略。 目的： 觀(guān)察不同時(shí)間點(diǎn)CCl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型的變化，尋求最佳的給藥時(shí)間點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)。觀(guān)察肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)對(duì)ccl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠基因治療的效果，探討Ad-HGF逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用機(jī)制。 方法： 1

3、.觀(guān)察CCh復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的動(dòng)態(tài)變化 40只雄性Wistar大鼠，隨機(jī)分為兩個(gè)大組：模型組(25只)、正常對(duì)照組(15只)。模型組大鼠采用CCl4復(fù)合法(40％CCl4/橄欖油、高脂低蛋白飼料、5％乙醇)制備大鼠肝纖維化模型，正常對(duì)照組大鼠皮下注射等量的橄欖油。于造模的1周，4周，8周末，從模型組和正常對(duì)照組中分別隨機(jī)各選取5只大鼠組成：1周模型組、1周正常組、4周模型組、4周正常組、8周模型組、8周正常組，并于這3個(gè)相應(yīng)的

4、時(shí)間點(diǎn)被分別處死。檢測(cè)大鼠血清生化指標(biāo)(GOT、GPT、TP、ALB、TBil)、肝指數(shù)以及肝組織中羥脯氨酸含量的變化；通過(guò)HE染色觀(guān)察肝臟組織病理學(xué)變化。確定最佳的給藥時(shí)間點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)。 2.觀(guān)察Ad-HGF對(duì)大鼠肝纖維化的治療作用25只雄性Wistar大鼠隨機(jī)平均分為5組：模型組，正常對(duì)照組，低(1×109pfu)、中(2.5x109 pfu)、高(5×109 piU)劑量治療組。模型組和治療組大鼠均采用cch復(fù)合法(40％

5、ccl4/橄欖油、高脂低蛋白飼料、5％乙醇)制備大鼠肝纖維化模型，正常對(duì)照組大鼠皮下注射等量的橄欖油。從最佳的給藥時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始，低、中、高劑量治療組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射相應(yīng)劑量Ad-HGF(3次/周，ivx2 wk)，模型組和正常組大鼠給予等體積生理鹽水。在最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)間點(diǎn)，處死所有大鼠。檢測(cè)血清生化指標(biāo)(GOT、GPT、TP、ALB、 TBil)以及肝組織中Hpy的含量；通過(guò)HE染色觀(guān)察肝臟組織病理學(xué)變化；通過(guò)天狼星染色觀(guān)察肝臟組織

6、中膠原的分布，并采用美國(guó)Image-Pro Plus專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件對(duì)天狼星染色的切片膠原面積進(jìn)行定量分析；運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)大鼠肝組織中HGF和TGF-βl的表達(dá)，其陽(yáng)性區(qū)域采用美國(guó)Imago-Pro Plus專(zhuān)業(yè)圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。 結(jié)果： 1.模型大鼠肝纖維化的階段性變化 與1周正常組比較，1周模型組大鼠血清生化指標(biāo)GOT、GPT、TBil(均P<0.01)和肝指數(shù)(P<0.05)顯著地升高；與4周

7、正常組比較，4周模型組大鼠血清中GOT、GPT、TBil，肝指數(shù)以及肝組織中Hyp含量均有顯著(均P<0.01)的升高，TPALB有顯著(均P<0.05)的下降。與8周正常組比較，8周模型大鼠血清中TP、ALB顯著(均P<0.01)下降，GOT、GPT、TBil(均P<0.05)以及肝組織中Hyp含量(P<0.01)均顯著增高。病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明：造模1周時(shí)，未見(jiàn)纖維組織形成；造模4周時(shí)，見(jiàn)大量纖維組織形成；造模8周時(shí)，見(jiàn)假小葉形成

8、。確定最佳的給藥時(shí)間點(diǎn)為造模4周末；最佳的實(shí)驗(yàn)終止的時(shí)間點(diǎn)為造模8周末。 2.Ad-HGF基因治療大鼠抗肝纖維化的作用 與模型組比較，高劑量組大鼠血清中的GOT、GPT、TP、ALB、TBil都有明顯的改善(P<0.05)，中劑量組和高劑量組肝組織中的膠原面積(P<0.05)、Hyp的含量(P<0.05)、肝細(xì)胞損傷程度和肝纖維化程度(P<0.01)都有顯著的下降。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：與模型組比較，Ad-HGF在低、中

9、、高劑量組均可以顯著地提高肝組織中HGF蛋白的表達(dá)(P<0.05)，顯著地降低肝組織中TGF-β1的表達(dá)(P<0.05)。 結(jié)論： 1.ccl4復(fù)合因素誘導(dǎo)的模型大鼠出現(xiàn)階段性肝纖維化改變。造模4周末是比較理想的給藥時(shí)間點(diǎn)，造模8周末是比較理想的造模結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)。2. Ad-HGF基因治療對(duì)ccl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有阻斷作用；其作用機(jī)制：1)促進(jìn)HGF基因在肝組織中的表達(dá)，從而發(fā)揮其促肝細(xì)胞再生、抑制肝細(xì)胞凋亡、減輕