漢灘病毒包膜糖蛋白H-2Kb限制性CTL表位的篩選與鑒定.pdf

1、【研究背景】
　　腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS），是一種急性病毒性傳染病，全球90％的 HFRS病例發(fā)生在我國(guó)，該病來(lái)勢(shì)兇猛，變化較快，病死率較高，一直以來(lái)嚴(yán)重危害我國(guó)人民的身心健康。漢灘病毒（Hantaan virus, HTNV）是引起我國(guó) HFRS的主要病原之一，探究 HTNV特異性 T細(xì)胞應(yīng)答規(guī)律以及鑒定HTNV結(jié)構(gòu)蛋白上相關(guān)表位對(duì)研究其免疫應(yīng)答機(jī)制

2、、免疫治療方法，以及研發(fā)HFRS新型疫苗均具有重要意義?，F(xiàn)有的多數(shù)研究表明，HTNV核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein, NP）上具有細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）表位，包膜糖蛋白（Glycoprotein, GP）上存在有中和表位和血凝表位。CTL在識(shí)別靶細(xì)胞后，可通過(guò)穿孔素途徑和死亡受體途徑殺傷病毒感染細(xì)胞，并引起感染細(xì)胞的死亡或凋亡，此外還可通過(guò)分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體免

3、疫功能。因此，HTNV CTL表位的研究對(duì)HTNV感染后的免疫保護(hù)和免疫治療十分關(guān)鍵。近期研究發(fā)現(xiàn)HTNV GP也具有誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答的能力，并明確了HTNV GP上存在輔助性T淋巴細(xì)胞（Helper T lymphocyte, Th）表位，而目前尚無(wú)HTNV GP上是否存在特異性CTL表位的成熟研究報(bào)道。若能在HTNV GP上發(fā)現(xiàn)并鑒定出CTL特異性表位，對(duì)于HTNV新型疫苗的研究具有重要意義。本研究利用生物信息學(xué)軟件對(duì)HTNV GP一

4、級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相關(guān)參數(shù)分析，最終預(yù)測(cè)并合成了15個(gè)H-2Kb限制性CTL表位肽，并對(duì)其進(jìn)行了篩選、鑒定及生物學(xué)活性和免疫學(xué)特性研究，以期明確HTNV GP上是否存在CTL特異性表位。
　　【研究方法】
　　用生物信息學(xué)表位預(yù)測(cè)軟件 IEDB（ Immune epitope database and analysis resource）將HTNV GP一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)參數(shù)分析，對(duì)可能存在的CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)；同時(shí)用另一生物信息學(xué)

5、軟件 BIMAS（ BioInformatics and molecular analysis section），綜合評(píng)價(jià)各預(yù)測(cè)表位與小鼠主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex, MHC）編碼產(chǎn)物H-2Kb分子的結(jié)合指數(shù)，最后初步篩選出15個(gè)H-2Kb限制性HTNV CTL表位肽并合成。
　　通過(guò)酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（Enzyme Linked Immunospot assay, ELI

6、SPOT），將HTNV感染C57BL/6小鼠脾細(xì)胞，分別用上述預(yù)測(cè)的15個(gè)HTNV CTL表位肽刺激，并用已知HTNV NP特異性CTL表位肽NP1作為陽(yáng)性對(duì)照，篩選出可有效刺激感染小鼠脾臟中T細(xì)胞分泌IFN-γ的多肽；進(jìn)而，以CD4+T細(xì)胞去除后的小鼠脾細(xì)胞（CD4 depleted SP）或CD8+T細(xì)胞去除后的小鼠脾細(xì)胞（CD8 depleted SP）作為效應(yīng)細(xì)胞，利用ELISPOT實(shí)驗(yàn)篩選并鑒定出能刺激CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的CT

7、L優(yōu)勢(shì)表位肽。通過(guò)CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，以HTNV感染小鼠脾細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，分別用抗原肽致敏的EL-4細(xì)胞和HTNV感染的巨噬細(xì)胞作為CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證各HTNV GP CTL表位肽是否具有刺激效應(yīng)細(xì)胞應(yīng)答的潛能。
　　在上述工作的基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究并分析了HTNV GP CTL表位肽的生物學(xué)活性及免疫學(xué)特性。通過(guò)淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CTL表位肽促進(jìn)C57BL/6小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral bloo

8、d mononuclear cell, PBMC）增殖的能力；采用胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法檢測(cè)CTL表位肽刺激小鼠脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。進(jìn)而，將CTL表位肽與弗氏佐劑充分乳化后，皮下多點(diǎn)注射免疫C57BL/6小鼠，以已知HTNV NP特異性CTL表位肽NP1、HFRS滅活疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照；以PBS、弗氏佐劑作為陰性對(duì)照?？偣裁庖?次，每次間隔10天，在末次免疫后第10天，通過(guò)ELISPOT和CTL殺傷實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)免疫小鼠脾細(xì)胞分泌IF

9、N-γ的能力以及CTL的特異性殺傷活性，進(jìn)而評(píng)價(jià)抗原表位肽在體內(nèi)所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答水平；通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA）和微量細(xì)胞中和實(shí)驗(yàn)，分別檢測(cè)免疫小鼠血清中抗HTNV NP及GP的特異性抗體滴度和中和抗體滴度，進(jìn)而評(píng)價(jià)抗原表位肽在體內(nèi)所介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答水平。同時(shí)取HTNV76-118株以105 pfu/只的感染劑量，采用肌肉注射的途徑感染免疫小鼠，病毒

10、感染后第3天，通過(guò)ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR），分別檢測(cè)免疫小鼠各組織臟器中HTNV特異性抗原和核酸。從而綜合評(píng)價(jià)CTL表位肽對(duì)HTNV感染小鼠的保護(hù)作用。
　　【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】
　　根據(jù)IEDB預(yù)測(cè)表位肽的Percentile Rank排名（Percentile Rank值越低，意味著預(yù)測(cè)的CTL表位

11、肽可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答能力越強(qiáng)），篩選出HTNV GP上排名前15個(gè)H-2Kb限制性CTL表位肽，均由8個(gè)氨基酸組成，分別為GP1（aa39-aa46：SVIGYVEL）、GP2（aa44-aa51：VELPPVPL）、GP3（aa64-aa71：SMDNHQSL）、GP4（aa208-aa215：IVCFFVAV）、GP5（aa420-aa427：VNFVCQRV）、GP6（aa456-aa463：ITSLFSLL）、GP7（a

12、a489-aa496：VTFCFGWV）、GP8（aa499-aa506：PAITFIIL）、GP9（aa797-aa804：ITIRYSRR）、GP10（aa845-aa852：TLLFFGPL）、GP11（aa925-aa932：QSFNTSTM）、GP12（aa987-aa994：VGFTLTCL）、GP13（aa1102-aa1109：FSGNWIVL）、GP14（aa1113-aa1120：CVFLLFSL）、GP15（aa1

13、114-aa1121：VFLLFSLV）；BIMAS綜合評(píng)價(jià)了各預(yù)測(cè)表位肽與H-2Kb分子的結(jié)合指數(shù)，表明預(yù)測(cè)的15個(gè)CTL表位肽均可與H-2Kb分子結(jié)合，結(jié)合指數(shù)越高意味著其與H-2Kb分子之間的親和力越大。
　　ELISPOT結(jié)果顯示，在預(yù)測(cè)的15個(gè) CTL表位肽中，只有 GP1、GP2、GP3、GP6、GP8、GP10等6個(gè)可誘導(dǎo)HTNV感染小鼠脾臟中T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，其平均斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)（Spot-forming

14、cells, SFC）分別為225，130，257，461，196，162。用上述6個(gè)陽(yáng)性抗原肽分別刺激去除CD4+T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞時(shí)，GP1、GP2、GP3、GP8、GP10均未明顯誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌 IFN-γ，而GP6保持較高的斑點(diǎn)數(shù)，其平均SFC為421；同時(shí)，用上述6個(gè)陽(yáng)性抗原肽分別刺激去除CD8+T細(xì)胞的淋巴細(xì)胞時(shí)，結(jié)果恰好相反，GP1、GP2、GP3、GP8、GP10刺激淋巴細(xì)胞后保持較高的斑點(diǎn)數(shù)，其平均SFC分別為216、

15、129、229、183、179，而GP6未明顯誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ。而且GP6的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陽(yáng)性對(duì)照NP1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。上述結(jié)果表明，GP6可能為HTNV GP特異性CTL優(yōu)勢(shì)表位肽。
　　CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng) HTNV感染的小鼠脾細(xì)胞分別用 GP6、陽(yáng)性對(duì)照 NP1刺激后作為效應(yīng)細(xì)胞，抗原肽致敏的 EL-4細(xì)胞（H-2Kb限制性）、HTNV感染的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作為靶細(xì)胞時(shí)，隨著效靶比（Effector cell/T

16、arget cell, E/T）的升高，其特異性殺傷活性也隨之提高；然而，當(dāng)抗原肽未致敏的EL-4細(xì)胞、HTNV未感染的巨噬細(xì)胞，以及P815細(xì)胞（H-2Dd限制性）作為靶細(xì)胞時(shí)，效應(yīng)細(xì)胞的非特異性殺傷活性均較低，未超過(guò)10%。結(jié)果表明，GP6能夠有效刺激CTL對(duì)HTNV感染的靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。
　　對(duì)HTNV GP6進(jìn)行生物學(xué)活性鑒定，其流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry, FCM）檢測(cè)結(jié)果顯示，GP6可有效刺激小鼠P

17、BMC的增殖，與陰性對(duì)照組相比，增殖的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例明顯增加，二者存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；并且GP6可強(qiáng)烈誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ，與陰性對(duì)照組相比，其IFN-γ+CD8+T細(xì)胞占CD8+T細(xì)胞總數(shù)比例明顯增加，二者存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。對(duì)HTNV GP6進(jìn)行免疫學(xué)活性檢測(cè)的結(jié)果表明，GP6可刺激C57BL/6小鼠產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，且免疫小鼠脾細(xì)胞IFN-γ應(yīng)答水平均顯著高于其他各組。CTL殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著E/T的

18、升高， GP6特異性 CTL的殺傷活性不斷增強(qiáng)。但 GP6未能誘導(dǎo) C57BL/6小鼠產(chǎn)生針對(duì)HTNV GP的特異性抗體以及中和抗體。
　　對(duì)免疫小鼠進(jìn)行動(dòng)物保護(hù)實(shí)驗(yàn)的ELISA結(jié)果顯示，在GP6和陽(yáng)性對(duì)照NP1免疫組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟中，其HTNV特異性抗原含量與PBS、弗氏佐劑對(duì)照組相比，明顯降低。qRT-PCR結(jié)果顯示，在GP6和陽(yáng)性對(duì)照NP1免疫組小鼠的肝臟、脾臟和腎臟中，其HTNV核酸載量與PBS、弗氏佐劑對(duì)照組相比

19、，明顯降低，該結(jié)果與ELISA檢測(cè)結(jié)果相一致。在GP6免疫組小鼠的肝臟、脾臟、腎臟中，其HTNV特異性抗原含量以及核酸載量，與陽(yáng)性對(duì)照NP1免疫組相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。上述結(jié)果表明，GP6在體內(nèi)所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)HTNV感染小鼠具有一定的保護(hù)作用。
　　【結(jié)論】
　　本研究成功篩選并鑒定出HTNV GP上一個(gè)CTL優(yōu)勢(shì)表位肽—GP6，可強(qiáng)烈誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并具有良好的生物學(xué)活性。將其與弗氏佐劑混合免疫C57BL/6