二硫化碳干擾巨噬細胞的極化和功能在胚胎植入障礙中的作用.pdf

1、研究背景
　　二硫化碳(Carbondisulfide，CS2)是一種常用的粘膠纖維工業(yè)合成品原料，普遍應用于服裝行業(yè)。服裝行業(yè)是一種以女性工作人員占主導的勞動密集型產(chǎn)業(yè)。近年來，CS2對女性生殖系統(tǒng)的影響引起普遍關(guān)注。流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，CS2職業(yè)暴露的女性較非職業(yè)人群生殖系統(tǒng)方面會受到不同程度的損害。本課題組前期對職業(yè)女工的流行病學調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，同對照組女性人群相比，CS2暴露的職業(yè)女工人群表現(xiàn)出高的早早孕丟失以及受孕時間明

2、顯延遲等特點。同時，小鼠動物實驗發(fā)現(xiàn)，CS2生殖毒性作用最為敏感的時期是胚胎植入期。由此可見，CS2具有明顯的生殖毒性，并會影響胚胎植入，但其機制尚不清晰。
　　母胎界面的免疫微環(huán)境保證了容受性子宮內(nèi)環(huán)境的建立，進而利于植入和妊娠。巨噬細胞在母胎界面微環(huán)境的建立中起著至關(guān)重要的作用。在胚胎植入期，母胎界面巨噬細胞積聚于此，清除凋亡細胞，分泌細胞因子，誘導免疫耐受;同時，分泌血管內(nèi)皮生長因子，促進母胎界面血管的形成與重塑，構(gòu)建胚胎發(fā)

3、育所需的營養(yǎng)物質(zhì)運輸?shù)奶ケP血管。此外，巨噬細胞參與卵巢黃體的形成，以保證正常雌、孕激素的分泌與運輸。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，圍植入期暴露于CS2可導致孕鼠子宮組織細胞炎性因子增多以及血清雌、孕激素水平下降，提示巨噬細胞與CS2致小鼠胚胎植入障礙過程密切相關(guān)。
　　綜上所述，植入期小鼠子宮和卵巢巨噬細胞極化和功能在CS2暴露后發(fā)生改變可能是其胚胎植入障礙的重要機制之一。因此，本研究利用已經(jīng)構(gòu)建的小鼠胚胎植入障礙模型，在胚胎植入期不同時點

4、暴露于二硫化碳后的不同時間斷面上，觀察小鼠卵巢和子宮組織中巨噬細胞極化和功能變化，以期揭示巨噬細胞極化和功能變化在二硫化碳致胚胎植入障礙中的作用。
　　研究目的
　　于小鼠受孕后植入期不同時間點暴露于CS2建立小鼠胚胎植入障礙模型，檢測不同暴露點后不同觀察終點子宮組織中巨噬細胞極化變化，并測定相關(guān)因子IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa的表達;同時，檢測卵巢組織中巨噬細胞極化變化，并測定相關(guān)因子TNF

5、-α、Cox2、Hif1-α和Vegfa的表達，以期闡明巨噬細胞極化與功能改變在CS2致小鼠胚胎植入障礙中的作用和機制。
　　研究方法
　　1.動物模型的建立
　　性成熟昆明種小鼠(8-12w)適應性喂養(yǎng)一周后進行合籠，雌雄合籠比例為1∶1。次日早晨8點檢查雌性小鼠陰栓，以陰栓陽性者定義為懷孕第一天(GD1)，并隨機分配到各組。模型共設(shè)3個染毒組（染毒時間點為GD3、GD4和GD5），并在各染毒時間點后的連續(xù)時間點設(shè)置

6、觀察終點（GD4、GD5、GD6和GD7，共計13個觀察終點），每個觀察終點含有12只孕鼠。染毒組以631.4mg/kg(0.4LD50)的劑量溶于橄欖油后進行腹腔注射，對照組腹腔注射等體積的橄欖油作為溶劑對照。
　　2.樣本收集與巨噬細胞極化與功能的檢測
　　于各個觀察終點收集孕鼠子宮組織和卵巢組織。應用流式細胞術(shù)檢測子宮內(nèi)膜組織巨噬細胞極化情況（F4/80:巨噬細胞;CD16/32:M1型巨噬細胞;CD206:M2型巨噬

7、細胞）。應用ELISA和實時熒光定量PCR的方法測定全子宮組織中IL-6、IL-10、IL-12、TGF-β1以及Vegfa蛋白和mRNA的表達水平。制備卵巢組織石蠟切片，HE染色后對卵巢中的黃體進行病理分析，并對病理評價指標進行評分定量分析;同時采用免疫組化染色方法測定iNOS和Arg-1表達水平以檢測卵巢黃體M1、M2巨噬細胞含量并進行定量分析。應用實時熒光定量PCR測定卵巢黃體中TNF-α、Cox2、Hif1-α以及VegfamR

8、NA的表達水平。
　　3.統(tǒng)計學分析
　　采用Excel進行數(shù)據(jù)的錄入，并應用SPSS19.0統(tǒng)計學分析軟件進行統(tǒng)計學分析并以P＜0.05定義為有統(tǒng)計學意義。將原始實驗組數(shù)據(jù)除以對照組數(shù)據(jù)，使原始數(shù)據(jù)結(jié)果標準化。測量指標先進行正態(tài)性檢驗，正態(tài)分布指標以均數(shù)±標準差表示。各組比較之前進行方差齊性檢驗。若方差齊，采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用DunnettTtest;若方差不齊，則選用Welch檢驗

9、，兩兩比較采用Dunnett'sT3test。此外，應用GraphPadPrism軟件繪制結(jié)果圖。
　　研究結(jié)果
　　1.CS2暴露對卵巢黃體結(jié)構(gòu)與功能的影響
　　圍植入期暴露于CS2后，相比于對照組，孕鼠卵巢黃體結(jié)構(gòu)和功能受到不同程度的損傷。在GD4染毒GD5觀察終點上，孕鼠卵巢黃體血管明顯擴張與充血(P＜0.05)，卵巢結(jié)構(gòu)明顯受損(P＜0.05)。同時，Cox2和Hif1-αmRNA測定結(jié)果顯示，兩種細胞因子均呈

10、現(xiàn)先升高后下降的趨勢，其中Cox2細胞因子的mRNA在GD3染毒GD5觀察終點表達水平明顯升高(P＜0.05)，而在GD5染毒GD7觀察終點表達水平明顯下降(P＜0.05);Hif1-α細胞因子的mRNA在GD3染毒GD4觀察終點、GD4染毒GD5觀察終點表達水平明顯升高(P＜0.05)，然后降至正常水平。提示，CS2暴露可導致孕鼠黃體損傷。
　　2.CS2暴露對卵巢黃體巨噬細胞極化平衡的影響
　　相比于對照組，圍植入期GD

11、3暴露組GD5觀察終點M1和M2巨噬細胞數(shù)量均明顯增加(M1:P＜0.05;M2:P＜0.01)，隨后，M1型巨噬細胞降低至正常水平而M2型巨噬細胞數(shù)量在GD6觀察終點明顯增加(P＜0.01)。同時，M2型巨噬細胞在GD7觀察終點（GD4和GD5染毒）明顯下降(P＜0.05)。在植入窗口期，M1/M2巨噬細胞極化平衡由M1型巨噬細胞為主導（M1＞M2在GD3染毒GD4觀察終點，P＜0.01）轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型巨噬細胞為主導（M1＜M2在GD5

12、染毒GD6觀察終點，P＜0.01）。
　　3.CS2暴露對子宮內(nèi)膜組織巨噬細胞極化平衡的影響
　　圍植入期GD3，GD4和GD5暴露于CS2后，各觀察終點子宮內(nèi)膜M2型巨噬細胞數(shù)量明顯低于對照組（在GD7觀察終點P＜0.01）;但M1型巨噬細胞數(shù)量于GD4染毒GD6觀察終點明顯升高(P＜0.05)。在植入窗口期，M1/M2巨噬細胞極化平衡由M1型為主導（GD3染毒GD4觀察終點，P＜0.05）轉(zhuǎn)變?yōu)镸2型為主導（GD3染毒G

13、D5觀察終點，P＜0.01），隨后又轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型為主(GD3染毒GD6和GD7觀察終點)。
　　4.CS2暴露對子宮與卵巢組織免疫因子表達水平的影響
　　圍植入期GD3暴露于CS2后GD4觀察終點，相比于對照組，子宮組織中IL-6的mRNA和蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05);而IL-12蛋白表達水平明顯下降(GD5，P＜0.01;GD7，P＜0.05)。另一方面，耐受因子的分泌變化紊亂，IL-10蛋白的表達水平在GD3染

14、毒GD4觀察終點(P＜0.05)和GD4染毒GD7觀察終點（P＜0.01）明顯升高，但在GD5染毒GD6觀察終點上表達水平明顯降低（P＜0.05）。TGF-β1蛋白表達水平在GD4和GD6觀察終點明顯升高(P＜0.05)，其mRNA表達水平在GD7觀察終點明顯下降(P＜0.01)。卵巢組織中，TNF-αmRNA的表達水平明顯升高（GD3染毒GD4觀察終點，P＜0.01;GD4染毒GD7觀察終點，P＜0.01;GD5染毒GD6觀察終點，P

15、＜0.05）。
　　5.CS2暴露對子宮與卵巢組織血管內(nèi)皮生長因子表達水平的影響
　　相比于對照組，圍植入期GD3染毒暴露于CS2后，子宮組織中VegfamRNA表達水平在GD4觀察終點明顯升高(P＜0.05)而在GD6觀察終點表達水平明顯下降(P＜0.05);Vegfa蛋白表達水平在GD5觀察終點明顯下降(P＜0.05)。卵巢組織中，VegfamRNA表達水平在GD4和GD7觀察終點上明顯升高(P＜0.01)。