Repair of the Osteonecrosis of the Femoral Head with Magnesium Alloy Rod Transfected Bone Morphogenetic Protein-2.pdf

1、目的:
　　股骨頭壞死(Avascular Necrosis of Femoral Head，ANFH))是由于多種病因造成股骨頭血液循環(huán)障礙，部分或完全性缺血，導(dǎo)致骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等活力成分變性和死亡，骨小梁斷裂，壞死區(qū)的力學(xué)強(qiáng)度逐漸下降，引起股骨頭塌陷，最終形成嚴(yán)重的骨關(guān)節(jié)炎。髖關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、激素過(guò)量使用和乙醇中毒是股骨頭壞死常見(jiàn)的病因。近年來(lái)，隨著對(duì)股骨頭壞死研究的不斷深入以及骨髓干細(xì)胞的應(yīng)用，使股骨頭壞死的治療有

2、了新的進(jìn)展。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal stem cells，BMSCs)來(lái)源于中胚層，具有多向分化潛能。在特定的條件下，可定向分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。同時(shí)還可分泌多種成骨活性因子，與骨組織再生和創(chuàng)傷愈合創(chuàng)造了有利條件，體內(nèi)外研究顯示在骨與軟組織損傷修復(fù)方面顯示出良好應(yīng)用前景。同時(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí):全身或局部注入人胚胎骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞很少發(fā)生移植排斥

3、反應(yīng)。由于外源性生長(zhǎng)因子半衰期短，局部使用很快被稀釋和代謝，須反復(fù)使用，從而帶來(lái)一些問(wèn)題。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在不影響細(xì)胞特殊表型的前提下，將編碼生長(zhǎng)因子的基因?qū)肽康募?xì)胞中。有研究通過(guò)基因表達(dá)產(chǎn)生內(nèi)源性生物活性物質(zhì)，調(diào)控細(xì)胞自身增殖分化，將細(xì)胞治療和基因治療結(jié)合起來(lái)，應(yīng)用于組織工程修復(fù)股骨頭壞死過(guò)程，提出了基因加強(qiáng)的組織工程(gene-enhanced tissue engineering)新理念。近年來(lái)，已有較多將單一生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)入種子細(xì)胞并

4、取得較高表達(dá)和較好效果的報(bào)道。轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的出現(xiàn)明顯提高了干細(xì)胞治療股骨頭壞死的療效。
　　骨形態(tài)生成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是一類酸性多肽，屬于TGF-β超家族結(jié)構(gòu)相關(guān)信號(hào)蛋白，能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，具有誘導(dǎo)新骨形成的作用，是目前最重要的新骨形成調(diào)控因子，主要由成骨細(xì)胞和瘤性成骨細(xì)胞分泌。骨形態(tài)生成蛋白能促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖和分化，如成骨

5、細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，并能誘導(dǎo)骨基質(zhì)的合成，在體外可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其堿性磷酸酶活性，刺激其分化。BMP-2在體內(nèi)，主要分布于骨膠原纖維、骨膜、骨髓基質(zhì)中，密質(zhì)骨的含量較松質(zhì)骨多。BMP-2是骨形成過(guò)程中惟一能獨(dú)立誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為骨細(xì)胞的調(diào)控因子。研究表明，低濃度的BMP-2可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞移行至骨組織形成部位;中等濃度的BMP-2能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞;高濃度的BMP-2則可促進(jìn)間充

6、質(zhì)干細(xì)胞增生。在臨床上，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)取自于骨髓，手術(shù)操作簡(jiǎn)便，來(lái)源較充足。大量研究表明，BMP-2與BMSCs在新骨生成過(guò)程中具有協(xié)同作用。本實(shí)驗(yàn)將BMP-2基因轉(zhuǎn)染入BMSCs，觀察轉(zhuǎn)染的BMSCs中BMP-2 mRNA和蛋白質(zhì)水平。分析BMP-2基因轉(zhuǎn)染在體外向成骨方向分化的情況。
　　采用植入鉭和鉭合金減壓金屬棒的方法是目前臨床上治療早期股骨頭壞死的一種方法。但鎂和鎂合金的彈性模量和密度比鉭合金更接近骨組織

7、的物理學(xué)性質(zhì)，具有比其他生物金屬材料密度小的優(yōu)點(diǎn)。它的密度接近人體骨組織密度，鎂及鎂合金和人體骨的彈性模量分別為45 GPa和3～20 GPa，由于相近的彈性模量鎂及鎂合金可以減少應(yīng)力遮擋效應(yīng)，減少局部骨質(zhì)疏松的發(fā)生和再骨折現(xiàn)象。由于金屬鎂及鎂合金無(wú)磁性，當(dāng)人體攜帶鎂及鎂合金時(shí)可以進(jìn)行核磁共振成像造影，這是金屬鎂及鎂合金在臨床應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)之一。更重要的是，鎂對(duì)人體的很多的新陳代謝有積極作用。在高氯離子的環(huán)境和動(dòng)物體內(nèi)，鎂和鎂合金材料有良好

8、的生物降解性。鎂是人體新陳代謝重要的原材料，主要通過(guò)小腸吸收，在人體中有很多重要的生理功能，是人體中許多酶的輔因子，它能抑制鈣離子在人體內(nèi)的積累，使血液中膽固醇含量降低，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗塞有一定的預(yù)防作用，并且它還能改善心臟的功能，穩(wěn)定生物體內(nèi)DNA和RNA的結(jié)構(gòu)。高濃度的鎂具有毒性，血清鎂水平超過(guò)1.05mmol/L可能導(dǎo)致肌肉癱瘓、低血壓、呼吸窘迫。綜上所述，鎂合金良好的力學(xué)特性、生物學(xué)相容性、可降解性和生物活性特征成為新型醫(yī)

9、用植入材料的明星材料。
　　本實(shí)驗(yàn)將骨形態(tài)生成蛋白-2（Bone Morphogenetic protein-2，BMP-2）轉(zhuǎn)染骨髓問(wèn)充質(zhì)細(xì)胞(bone morrow mesenchymal stem cell，BMSCs)，復(fù)合鎂合金金屬棒植入兔股骨頭壞死模型病變部位，通過(guò)術(shù)后定期檢測(cè)動(dòng)物生化指標(biāo)、組織學(xué)形態(tài)、影像學(xué)改變，從而評(píng)價(jià)鎂合金和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合骨形態(tài)生成蛋白治療兔股骨頭壞死的效果和鎂合金作為植入材料的安全性和有效

10、性。
　　方法:
　　1.液氮冷凍法建立股骨頭壞死模型所有實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物均以右側(cè)股骨頭建立壞死模型。參照臨床上人股骨頭髓芯減壓術(shù)的操作步驟，取俯臥位，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)3％戊巴比妥腹腔注射(30mg/Kg)的方法進(jìn)行麻醉;確定股骨頭位置后取外側(cè)切口，切開(kāi)關(guān)節(jié)囊，充分暴露外旋股骨頭（以未出現(xiàn)髓關(guān)節(jié)脫位為準(zhǔn)），然后從外背側(cè)向股骨頭方向直至關(guān)節(jié)軟骨下鉆孔，所用鉆頭直徑為3.5 mm，采用刮匙刮除股骨頭內(nèi)骨質(zhì)的方法造成約50％左右的骨缺損，最

11、后用液氮灌注法持續(xù)冷凍股骨頭大約5 min。
　　2.BMP-2轉(zhuǎn)染BMSCs及鑒定成年新西蘭大耳白兔髂后上嵴抽骨髓組織，種植于細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于DMEM培養(yǎng)基中，37℃、體積分?jǐn)?shù)5％ CO2孵箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。取培養(yǎng)的第三代細(xì)胞，分離鑒定BMSCs，采用電轉(zhuǎn)法將BMP-2基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至BMSCs細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后分成2組，采用反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測(cè)各組BMSCs的BMP-2基因的mRNA表達(dá)水平;采用Western-blot法檢測(cè)

12、各組BMSCs的BMP-2蛋白表達(dá)水平。隨后復(fù)合于明膠海綿上，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h后備用。
　　3.動(dòng)物分組用X線片鑒定動(dòng)物模型，隨機(jī)分成空白組（A組）、BMSCs組（B組）、鎂棒/BMSCs組（C組）、鎂棒組（D組）4組，每組10只。動(dòng)物麻醉成功后，空白組不做處理，BMSCs組植入轉(zhuǎn)染成功的BMSCs，鎂棒/BMSCs組植入鎂棒和轉(zhuǎn)染后的BMSCs，鎂棒組植入鎂棒。所有動(dòng)物均用右側(cè)股骨頭實(shí)驗(yàn)。
　　4.植入后第6周、第1

13、2周觀察兔股骨頭修復(fù)情況于第6周和第12周每組取兩只動(dòng)物行HE染色及Masson染色觀察骨小梁生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　5.植入后第6周、第12周實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝、腎、肺毒性及化驗(yàn)檢查用HE染色對(duì)兔肝、腎、肺組織進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。用生化法檢測(cè)動(dòng)物血、尿標(biāo)本的鎂離子濃度。
　　結(jié)果
　　1.BMP-2基因轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定 Western-blot法和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，外源性BMP-2基因通過(guò)體外電轉(zhuǎn)成功轉(zhuǎn)染BMSCs并表達(dá)相

14、應(yīng)的mRNA及蛋白。
　　2.動(dòng)物模型股骨頭X線檢查結(jié)果
　　A組標(biāo)本:術(shù)后6周時(shí)，模型側(cè)股骨頭密度降低，骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂;術(shù)后12周時(shí)，股骨頭密度增高，骨小梁結(jié)構(gòu)不清，軟骨下囊性變。B組標(biāo)本:術(shù)后6周、12周時(shí)，骨組織只在鉆孔區(qū)邊緣密度增高，而鉆孔區(qū)內(nèi)骨組織密度無(wú)明顯變化。C組標(biāo)本:骨修復(fù)效果明顯較A組、B組好，股骨頭外形恢復(fù)良好，骨密度亦降低;術(shù)后12周時(shí)鉆孔區(qū)密度接近周?chē)琴|(zhì)，股骨頭內(nèi)出現(xiàn)規(guī)則連續(xù)骨小梁，鉆孔邊緣交界區(qū)骨

15、小梁接合良好。D組標(biāo)本:在6周和第12周時(shí)，股骨頭可見(jiàn)明顯的骨修復(fù)，但骨密度較低。
　　3.股骨頭組織切片觀察
　　A組標(biāo)本:術(shù)后6周時(shí)，模型側(cè)ANFH部位出現(xiàn)較多破骨細(xì)胞，骨小梁形狀不規(guī)則，關(guān)節(jié)軟骨面磨損嚴(yán)重，少數(shù)模型的關(guān)節(jié)軟骨面出現(xiàn)塌陷;術(shù)后12周時(shí)，關(guān)節(jié)軟骨而磨損現(xiàn)象與修復(fù)現(xiàn)象并存，骨髓纖維化和增生同時(shí)可見(jiàn)，骨吸收和軟骨面塌陷被發(fā)現(xiàn)。B組標(biāo)本:術(shù)后4周時(shí)，骨缺損處成骨細(xì)胞稀少，進(jìn)而僅鉆孔區(qū)逐漸形成骨髓組織，鉆孔邊緣出現(xiàn)

16、少量類骨質(zhì)及新生骨小梁。16周時(shí)其軟骨面的磨損、骨小梁的紊亂以及股骨頭的塌陷都與模型對(duì)照組相似。C組標(biāo)本:術(shù)后6周時(shí)，骨小梁排列基本規(guī)則，有大量的骨細(xì)胞形成;術(shù)后12周時(shí)，可見(jiàn)骨小梁排列規(guī)則，飽滿，骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)，造血細(xì)胞豐富，已為正常股骨頭組織學(xué)表現(xiàn)。D組標(biāo)本:對(duì)于鎂棒組（D組）骨小梁骨密度較低，僅略高于空白組的骨密度。
　　4.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝腎肺毒性及化驗(yàn)檢查
　　第6周和第12周兔肝組織HE染色鏡下觀察大部分肝細(xì)胞組織形

17、態(tài)正常、肝小葉結(jié)構(gòu)正常;取兔腎組織鏡下觀察未見(jiàn)腎小管細(xì)胞壞死，腎小球組織形態(tài)正常取兔肺組織行HE染色鏡下觀察肺組織組織形態(tài)正常、未見(jiàn)肺纖維化。術(shù)后第6周和第12周鎂棒組和鎂棒/BMSCs組靜脈血、尿樣本的鎂離子濃度均在正常范圍內(nèi)。
　　結(jié)論:
　　1.體外電轉(zhuǎn)重組BMP-2表達(dá)載體至BMSCs，細(xì)胞毒性低，不影響其在支架材料上的增殖和成骨分化。
　　2.BMP-2基因轉(zhuǎn)染BMSCs復(fù)合鎂金屬棒，可促進(jìn)兔股骨頭的壞死組織