系統(tǒng)流行病學網(wǎng)絡差異比較的統(tǒng)計方法及其應用研究.pdf

1、對人類疾病遺傳與環(huán)境的病因?qū)W研究一直是流行病學的重要任務。然而，傳統(tǒng)“黑盒子”流行病學往往側(cè)重于識別單一危險因素，并未聚焦網(wǎng)絡對疾病的影響，因而難以深層次地探討致病機制。研究者渴望打開“黑盒子”，闡明致病因素如何通過“黑盒子”中的病因鏈環(huán)節(jié)而導致疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸結(jié)局。高通量組學技術的成熟發(fā)展與檢測成本的大幅度減低，使得流行病學家有機會將系統(tǒng)生物學理論方法與傳統(tǒng)流行病學有機結(jié)合，借助于豐富多彩的組學標記在大樣本人群中闡明“暴露”到“疾

2、病結(jié)局”的作用機制，從而催生了一個嶄新的流行病學分支學科—系統(tǒng)流行病學。本課題組將系統(tǒng)流行病學的學科內(nèi)涵概括為:將高通量組學技術與傳統(tǒng)流行病學研究相互融合，利用基因組(Genome)、表觀組(Epigenome)、轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)、蛋白組(Preteome)、代謝組(Metabolome)、表型組(Phenome)等生物組學標記，結(jié)合生物信息學網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫的通路信息，采用系統(tǒng)生物學方法構(gòu)建“暴露因子-組學生物標記-疾病

3、終點”間的交互網(wǎng)絡，并檢測不同狀態(tài)下（例如疾病組與健康組）網(wǎng)絡間的差異，以推斷危險因子導致疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸的致病網(wǎng)絡或特定致病通路及其效應大小;從而，為進一步闡明危險因子致病通路及流行病學作用機制、實驗室功能驗證、藥物靶點設計、預防或診療措施制定與評估提供科學依據(jù)。系統(tǒng)流行病學為在人群水平上闡明疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機制描繪了宏偉藍圖，它將實現(xiàn)從獨立病因研究向病因網(wǎng)絡研究的跨越性轉(zhuǎn)變。在這一轉(zhuǎn)變進程中，病因網(wǎng)絡構(gòu)建與致病通路識別將是打

4、開“黑盒子”的重要策略，而網(wǎng)絡差異的比較正是獲取致病網(wǎng)絡及致病通路統(tǒng)計學證據(jù)的重要方法。因此，系統(tǒng)流行病學的核心是在人群水平上通過“暴露因子-組學生物標記-疾病終點”網(wǎng)絡/通路的組間差異統(tǒng)計學比較，推斷危險因子導致疾病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的網(wǎng)絡/通路及其效應大小。
　　任何破壞網(wǎng)絡/通路交互結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計學比較方法勢必會丟失信息，失去其系統(tǒng)流行病學意義。然而，目前在流行病學研究中，仍以卡方檢驗、t檢驗或回歸分析等傳統(tǒng)方法作為生物標記組間差

5、異比較的主流方法。這些方法武斷地將原本是相互作用（或調(diào)控）的網(wǎng)絡節(jié)點假定為近似相互獨立狀態(tài)，忽略了它們間的交互網(wǎng)絡結(jié)構(gòu);所以，除了得到生物標記組間差異的基本信息外，既不能得到組間網(wǎng)絡差異信息，更不能推斷出特定危險因素的致病通路及其效應大小。最近，盡管在一些高質(zhì)量的人群組學研究中，已經(jīng)注重通過后續(xù)功能實驗驗證和生物信息學方法推斷出調(diào)控網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)，但因缺乏組間網(wǎng)絡差異比較的有效統(tǒng)計學方法，也只能定性地分析網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)特征，仍難以在人群水平

6、上定量推斷危險因子的致病網(wǎng)絡/通路及其效應大小。因此，發(fā)展網(wǎng)絡差異比較的統(tǒng)計分析方法，在人群水平上，比較不同組間的網(wǎng)絡差異，進而推斷危險因子的致病通路及其效應大小，就成為系統(tǒng)流行病學統(tǒng)計分析的重要任務。
　　必須澄清的是，盡管系統(tǒng)流行病學強調(diào)用高通量組學分析技術在人群水平上獲得組學標記大數(shù)據(jù)，但在實際工作中，因研究假設、目的或條件的不同，常常需要在2種不同研究策略下推斷網(wǎng)絡差異:
　　1）基于分子流行病學方法的假設驅(qū)動(Hy

7、pothesis-Driven)研究策略:研究者在深入理解所研究疾病的生理、生化及病理機制基礎上，綜合以往細胞（動物）實驗或組學分析結(jié)果，借助生物信息學網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫通路信息，事先勾畫出一個假定合理的致病網(wǎng)絡/通路。進而，用分子流行病學方法檢測網(wǎng)絡/通路節(jié)點上的生物標記，并在人群水平上檢驗組間網(wǎng)絡/通路差異及其效應。以期在人群中驗證所假設致病網(wǎng)絡/通路的真實性及實用性（設計藥物靶點、預測疾病發(fā)生預后、制定及評估預防或診療策略等）。
　

8、　2）基于高通量組學技術的數(shù)據(jù)驅(qū)動(Data-Driven)研究策略:研究者在不受任何假設限制的情況下，利用各種高通量組學技術，在人群水平上獲得研究樣本的組學標記數(shù)據(jù)。進而，借助系統(tǒng)生物學方法構(gòu)建“暴露因子-組學生物標記-疾病終點”網(wǎng)絡模型，并在人群水平上檢驗“對比組”間網(wǎng)絡/通路差異及其效應。為進一步實驗驗證、藥物靶點確定、制定預防或診療措施提供依據(jù)。無論是假設驅(qū)動還是數(shù)據(jù)驅(qū)動的研究策略，均存在無向網(wǎng)絡比較和有向網(wǎng)絡比較兩種情形。前者

9、側(cè)重點是比較“對比組”間網(wǎng)絡節(jié)點及其相互作用（相關關系）的統(tǒng)計學差異，而后者側(cè)重點則是比較網(wǎng)絡節(jié)點及其調(diào)控關系的統(tǒng)計學差異。因此，系統(tǒng)流行病學硼究中網(wǎng)絡差異比較的檢驗方法，應包括無向網(wǎng)絡比較和有向網(wǎng)絡比較2種情形。
　　在系統(tǒng)流行病學研究中，生物網(wǎng)絡不僅具備復雜網(wǎng)絡的一般性質(zhì)（自組織、自相似、吸引子、小世界、無標度等），更重要的是，對于多數(shù)復雜疾病的致病網(wǎng)絡而言，其“節(jié)點”和“邊”的連續(xù)定量變化譜蘊含著網(wǎng)絡差異的全部信息;即，節(jié)點

10、和邊多不是“全有或全無（1或0）”式的“開或關”模式，而是多表現(xiàn)為由0→1的定量漸變式的模式。即使有些基因（如某些致癌基因）在健康狀態(tài)下幾乎不表達而呈現(xiàn)“全有或全無”模式，其實質(zhì)也可看作是連續(xù)表達譜上的一個極端特殊情形。因此，系統(tǒng)流行病學網(wǎng)絡的差異囊括了“節(jié)點”和“邊”的雙重差異，單純“節(jié)點”或單純“邊”的差異遠不能代表其全部信息的差異。對于有向網(wǎng)絡，網(wǎng)絡差異絕非僅僅是其“節(jié)點”和“邊”兩部分差異的簡單合并，還應充分體現(xiàn)網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)所蘊

11、含的方向信息，即調(diào)控網(wǎng)絡內(nèi)“邊”的箭頭指向及“上游節(jié)點”對“下游節(jié)點”的調(diào)控權重。
　　然而，目前在系統(tǒng)生物學或人群組學研究中，現(xiàn)有的網(wǎng)絡比較算法（或統(tǒng)計量）多數(shù)未能涵蓋統(tǒng)計量構(gòu)建中所必需的上述全部信息。因而，不適合推廣到系統(tǒng)流行病學研究中網(wǎng)絡差異比較上。存在的問題可概括為如下4個方面:
　　1）最極端的情況是上述討論過的傳統(tǒng)方法（卡方檢驗、t檢驗等），它們完全忽略了網(wǎng)絡的“邊差異信息”。
　　2）系統(tǒng)生物學中的網(wǎng)絡比

12、較算法和軟件，多是針對網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)特征指標，對“邊”進行操作而不注重“節(jié)點”信息。主要采取網(wǎng)絡對齊、網(wǎng)絡相似性比較或聚類、網(wǎng)絡路徑搜索等方法比較網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)差異。
　　3）生物信息學中的生物網(wǎng)絡比較方法，多數(shù)是對“點”進行標準化使其均值為0方差為1后（無疑損失了點的變異信息），再針對“邊”的差異著重檢測“點”之間的連通性，包括通過節(jié)點中心性比較以尋找關鍵節(jié)點或通路、基于網(wǎng)絡模體頻率比較網(wǎng)絡拓撲差異、基于網(wǎng)絡間不相似性度量構(gòu)建網(wǎng)絡差

13、異比較統(tǒng)計量、基因芯片差異表達連通分析等。
　　4）尚缺乏考慮有向網(wǎng)絡內(nèi)“邊”的箭頭指向及“上游節(jié)點”對“下游節(jié)點”調(diào)控權重的有向網(wǎng)絡比較方法。
　　為解決以上問題，本研究在系統(tǒng)流行病學框架下，從統(tǒng)計學和系統(tǒng)生物學的雙重視角，審視生物網(wǎng)絡“節(jié)點”與“邊”共變特征，采取“結(jié)構(gòu)拆分→數(shù)理整合”的研究策略，構(gòu)建融合網(wǎng)絡“節(jié)點”、“邊”和“方向”差異信息的“系統(tǒng)流行病學網(wǎng)絡差異比較的統(tǒng)計分析方法體系”。圖1是本論文的研究框架。

14、>　　如圖1(1)所示，盡管“對比組”間網(wǎng)絡差異類型有5種，若將情形b）、c）、d)、e)中節(jié)點或邊的去除或增加均看作是情形a）中的“虛擬”點或邊，則所有情形均可歸屬于情形a）;此時去掉的點或邊的取值為0，而增加的點或邊的取值為其相應的節(jié)點測量值及相關程度。如圖1(2)所示，假設兩“對比組A、B”的樣本量分別為nA、nB，nA+nB=N。根據(jù)上述“虛擬”點或邊的思想，A、B兩“對比組”對應的網(wǎng)絡均可視為具有M個節(jié)點K條邊。用GA(VA，

15、EA)表示A組對應的網(wǎng)絡，其中VA=（xA1，xA2，…，xAM）為其節(jié)點集合。EA=(IAijσAij）M×M為其邊集合（更詳細的矩陣表達形式見圖1），其中，IAij=｛1,存在節(jié)點xAi與xAj之間的邊為0,其它示性函數(shù)，表示節(jié)點xAi與xAj之間的連接狀態(tài)，即IA=（IAij）M×M在無向網(wǎng)絡中僅表示節(jié)點xAi與xAj是否連接，此時IAij=IAji，而在有向網(wǎng)絡中，當節(jié)點xAj與xAj的連接狀態(tài)為xAi→xAj（i≠j，xAi，

16、xAj∈VA）時，IAji=1，IAji=0，反之亦然;σAij表示節(jié)點xAj與xAi之間的連接強度（可用相關系數(shù)等度量）。相應地，GB(VB，EB)表示B組對應的網(wǎng)絡，其中VB=(xB1，xB2，…，xBM)為其節(jié)點集合，EB=（IBijσBij）M×M為其邊的集合，而IB=(IBij)M×M為連接狀態(tài)集合。本研究構(gòu)建“對比組”間網(wǎng)絡差異檢驗統(tǒng)計量的基本策略為“結(jié)構(gòu)拆分→數(shù)理整合”。
　　其基本思想是:
　　1）結(jié)構(gòu)拆分:

17、先將對比組A與B的網(wǎng)絡GA(VA，EA)與GB(VB，EB)的拓撲結(jié)構(gòu)分別拆分為節(jié)點信息（VA，VB）、邊信息（EA，EB）和方向信息（IA，IB），再求兩對比組間相應的節(jié)點信息、邊信息和方向信息的差值（即效應）DV=(VA-VB)、DE=(EA-EB)和Dl=(IA-1B)。
　　2）數(shù)理整合:通過數(shù)理統(tǒng)計手段，將節(jié)點信息、邊信息和方向信息的差值（效應）DV、DE和Dl整合為兩“對比組”間網(wǎng)絡差異（效應）的統(tǒng)計量Diff=(DV

18、∪DE∪D);該統(tǒng)計量將網(wǎng)絡的“節(jié)點”、“邊”和“方向”差異信息融為一體。
　　在上述研究策略框架內(nèi)（圖1），本論文針對致病網(wǎng)絡差異囊括“節(jié)點”、“邊”和“方向”的共變特征，重點研究了以下幾個關鍵問題:
　　1）提出網(wǎng)絡差異比較的“結(jié)構(gòu)拆分→數(shù)理整合”的研究策略。
　　2）整合網(wǎng)絡“節(jié)點”和“邊”的雙重連續(xù)漸變差異信息，發(fā)展了致病通路識別及其效應估計的統(tǒng)計推斷模型（第二章）和無向網(wǎng)絡組間差異比較的得分檢驗方法（第三章）

19、。
　　3）整合網(wǎng)絡“節(jié)點”與“邊”雙重差異信息、以及上下游節(jié)點調(diào)控加權信息，發(fā)展了“有向網(wǎng)絡”組間差異比較的檢驗方法（第四章）。
　　4）基于聯(lián)合密度估計的非參數(shù)方法，建立了致病交互網(wǎng)絡篩選模型并對其預測效果進行了系統(tǒng)評價（第五章）。具體分述如下:
　　一、致病通路識別及其效應估計的統(tǒng)計推斷模型研究（第二章）
　　在傳統(tǒng)“黑盒子”流行病學研究中，通常采用病例對照設計或隊列研究分析暴露危險因素與疾病的關聯(lián)性。其策

20、略是通過比較病例組與對照組之間某危險因子的暴露比例而計算OR（比如吸煙與肺癌之間的OR=6.5等）或比較暴露組與非暴露組之間的疾病發(fā)病率而計算RR（比如吸煙與肺癌之間的RR=5.5等），以闡明暴露與疾病的關聯(lián)強度。這種基于變量獨立假設的統(tǒng)計推斷方法(logistic回歸、Cox回歸等)只能提供危險因素與疾病之間的關聯(lián)性及其強度大小，并不能闡明危險因素通過“黑盒子”導致疾病結(jié)局的病因鏈及其致病通路。然而，在不明確暴露因素導致疾病發(fā)生、發(fā)展

21、與轉(zhuǎn)歸的致病通路或網(wǎng)絡的情況下，往往很難有效地預測和評估干預暴露因素的效果，且難以得出令人信服或可重復驗證的結(jié)論。鑒于此，流行病學家一直期望能夠打開“黑盒子”，并挖掘特定危險因子致病網(wǎng)絡或通路。
　　盡管病因網(wǎng)絡的概念早己被提出，但由于缺乏有效的致病通路識別及其效應估計的統(tǒng)計推斷方法，流行病學家一直未能實現(xiàn)上述夙愿。為此，本研究在上述系統(tǒng)流行病學研究框架（圖1）下，遵循路徑分析的基本原理，構(gòu)建了識別致病通路并對其進行統(tǒng)計學假設檢驗

22、的推斷方法。以病例對照研究為例，其基本理念是:設病例組中的特定通路為XD1βD1→XD2βD2→XD1…βDK→XDk+1，若該通路路徑系數(shù)乘積ΠKk=1βDk≠0，則表明暴露（或生物標記）XD1可以通過該病因鏈將其效應傳遞到生物標記XDk+1，其效應量為βD=ΠKk=1βDk;同理，對照組中該通路XC1βC1→XC2βC2→…XC1…βCk→XCk+1的效應量為βc=ΠKk=1βCk;則該通路對疾病的貢獻可用統(tǒng)計量D=βD-βC=ΠK

23、k=1βDk-ΠKk=1βCk來測量。當H0∶D=βD-βC=0成立時，表明上述通路對疾病無效應。本研究將統(tǒng)計模擬與實例分析有機結(jié)合，對上述統(tǒng)計量進行了系統(tǒng)科學的評價。
　　主要結(jié)果:
　　(1)致病通路識別的檢驗統(tǒng)計量
　　采取如下統(tǒng)計量構(gòu)建和檢驗策略來識別致病通路:
　　1）非參數(shù)bootstrap置信區(qū)間檢驗方法，其統(tǒng)計量PEM-D定義為: D=βD-βC=ΠβDk-KΠk=1βCk其中K為通路長度，表示該

24、通路中有K+1個節(jié)點（變量）和K條邊，βDk和βCk分別表示病例組與對照組通路中第尼個節(jié)點和第k+1個節(jié)點之間的標準化回歸系數(shù)（即路徑系數(shù)）。采用百分位數(shù)bootstrap置信區(qū)間(percentile bootstrap confidenceinterval)以及偏差校正后的bootstrap置信區(qū)間(bias-corrected bootstrap confidenceinterval)進行非參數(shù)檢驗，以檢驗H0∶D=βD-βC=0

25、是否成立。
　　2）漸進正態(tài)分布統(tǒng)計量(PEM-UD):統(tǒng)計模擬表明，以下統(tǒng)計量UD=βD-βC√var(βD)+var(βC)近似服從正態(tài)分布，其中var(βD)和var（βC）分別表示βD和βC的方差，分別采用精確估計(the exact estimator)方法var(β)exact=ΠKk=1(s2βk十β2k)-ΠKk=1β2k、無偏估計(unbiased estimator)方法var(β)unbiased=ΠKk=1

26、β2k-ΠKk=1(β2k-s2βk)、多元delta估計(multivariate delta estimator)方法var(β)mult-delta=△cov(β1，β2，…，βk)△T（其中△=[(e)β/(e)β1，…，(e)β/(e)βk]）和bootstrap方法進行估計。
　　(2)統(tǒng)計模擬
　　針對上述統(tǒng)計量，在H0∶D=βD-βC=0成立的前提下遍歷不同樣本量(2)，評估其犯第一類錯誤的概率是否穩(wěn)定在給定

27、的檢驗水準α附近。在H1∶D=βD-βC≠0成立的條件下，設定不同樣本量（n），通路長度（K)，效應大?。é?βD-βC）以及路徑系數(shù)相關模式（即路徑系數(shù)向量的取值模式），評估統(tǒng)計量的檢驗效能。模擬結(jié)果顯示:
　　1）統(tǒng)計量PEM-D采用兩種bootstrap置信區(qū)間檢驗，統(tǒng)計量PEM-UD采用四種方法計算方差，在H0成立的前提下，當樣本量達到200時，其犯第一類錯誤的概率均穩(wěn)定在給定的檢驗水準（α=0.05）附近（表2.2）表明

28、所構(gòu)建的統(tǒng)計量具有良好的穩(wěn)定性。
　　2）對于上述六種情況，在H0不成立時，其模擬結(jié)果（見圖2.2-圖2.4）顯示:隨著樣本量和效應δ的增加，統(tǒng)計量的檢驗效能均呈單調(diào)遞增趨勢;固定樣本量及效應δ時，隨著通路長度K的增加，統(tǒng)計量仍然具有足夠高的檢驗效能，表明統(tǒng)計量檢驗效能不受通路長度的影響;固定樣本量及效應δ時，隨著路徑系數(shù)增大，統(tǒng)計量檢驗效能有所降低，表明在路徑系數(shù)較大時需要更大的樣本量才能達到足夠高的檢驗效能?？傮w而言，在上述六

29、種情形中百分位bootstrap方法、偏差校正的bootstrap方法、bootstrap估計方差法的穩(wěn)定性和檢驗效能均較好，尤其是偏差校正bootstrap置信區(qū)間的檢驗效能最高。
　　(3)實例分析
　　采用上述統(tǒng)計量PEM-D和PEM-UD，分析基于病例對照設計的急性髓性白血病(AML)分子流行病學數(shù)據(jù)（包含98例患者和35例對照個體的骨髓中T17細胞，Treg細胞和細胞轉(zhuǎn)化生長因子TGF-ββ的檢測數(shù)據(jù)）。結(jié)果表明:

30、除精確估計法外，其余五種方法均發(fā)現(xiàn)通路Treg→TGF-ββ→Th17與AML具有關聯(lián)性（表2.3）。實驗性研究也早己證實，Treg、TGF-ββ和Th17均與AML有關聯(lián)，且Th17細胞和Treg細胞在功能上具有相互抑制作用。我們的研究結(jié)果進一步表明通路Treg→TGF-β→Th17對AML的發(fā)生具有重要意義。
　　結(jié)論:
　　統(tǒng)計量PEM-D和PEM-UD均具有良好的統(tǒng)計學性能，可用于識別和檢驗致病通路，其中bootst

31、rap非參數(shù)檢驗方法更加高效。
　　主要創(chuàng)新點:
　　構(gòu)建了基于路徑系數(shù)連乘積之差的致病通路識別檢驗統(tǒng)計量，為系統(tǒng)流行病學中致病通路識別提供了新方法。
　　二、無向網(wǎng)絡組間差異比較的假設檢驗方法研究（第三章）
　　比較和檢驗對比組間（病例組VS對照組、暴露組VS非暴露組、干預組VS非干預組）網(wǎng)絡的統(tǒng)計學差異，是系統(tǒng)流行病學研究中識別致病通路、闡明暴露因子或干預措施對疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸機制影響的核心任務。然而，目

32、前尚缺乏網(wǎng)絡比較的統(tǒng)計學檢驗方法。對于多數(shù)復雜疾病的致病網(wǎng)絡而言，其“節(jié)點”和“邊”的連續(xù)定量變化譜蘊含著網(wǎng)絡差異的全部信息;因此，系統(tǒng)流行病學網(wǎng)絡的差異囊括了“節(jié)點”和“邊”的雙重差異，單純“節(jié)點”或單純“邊”的差異遠不能代表其全部信息的差異。在構(gòu)建“對比組”間網(wǎng)絡差異比較的統(tǒng)計量時，必須同時包含“節(jié)點”和“邊”的差異;即，在統(tǒng)計量中，用對比組間網(wǎng)絡“節(jié)點平均量”的差來刻畫節(jié)點平均水平的組間差異，而用網(wǎng)絡節(jié)點間“邊變化”的差來刻畫節(jié)點

33、相互作用（邊）的差異。當不明確或不考慮網(wǎng)絡中節(jié)點間的方向時，可根據(jù)圖1中無向網(wǎng)絡比較的統(tǒng)計量構(gòu)建方法，融合經(jīng)典統(tǒng)計量構(gòu)建策略（例如得分檢驗統(tǒng)計量，似然比檢驗統(tǒng)計量，wald檢驗統(tǒng)計量），綜合考慮節(jié)點和邊的信息，構(gòu)建相應的無向網(wǎng)絡比較統(tǒng)計量。本章將借助得分檢驗統(tǒng)計量的理論構(gòu)建無向網(wǎng)絡比較的統(tǒng)計檢驗方法。其基本思想是，在上述“結(jié)構(gòu)拆分→數(shù)理整合”策略（圖1）中可不考慮方向差異。則兩“對比組”間網(wǎng)絡差異檢驗統(tǒng)計量的一般形式可簡化為Diff=(

34、DV∪DE)。
　　主要結(jié)果:
　　(1)無向網(wǎng)絡組間差異比較的統(tǒng)計量
　　令GD與GC分別表示兩對比組的網(wǎng)絡，并假定GD與GC具有相同的拓撲結(jié)構(gòu)（M個節(jié)點、K條邊）;理論上，對比組間（病例組VS對照組、暴露組VS非暴露組、干預組VS非干預組）網(wǎng)絡節(jié)點取值和邊的強度之間的差異，可以表征致病效應或干預效果。以病例對照研究為例，給定病例組與對照組的樣本量分別為nD和nC，當原假設H0∶GD=GC成立時，兩組間的對應網(wǎng)絡節(jié)點

35、總體均值相等，即μD=μC（i=1，…，M）;同時兩組間各對應邊的強度相等βDk=βCk（k=1，…，K）。根據(jù)得分檢驗(score test)思想，在H0∶GD=GC成立的前提下兩組樣本可合并為N=nD+nC;則對于個體l(l=1，2，…，N)，定義Y1=｛1,l∈病例組（D）0，l∈對照組(C),其第i個點的取值為xli。則，節(jié)點xi對兩“對比組”間網(wǎng)絡差異貢獻（即效應大?。┑牡梅譃镈Vi=∑Nl=1（Yi-Y-）xli，i=1，…

36、，M，從而，得到“節(jié)點差異效應”得分向量DV=（Dv1，Dv2，…，DvM）T。類似的，第k條邊·(xi)-·(xj)對兩“對比組”間網(wǎng)絡差異貢獻（即效應大?。┑牡梅譃镈Ek=∑NL=1（Y1-Y-）（xli-xil）（xlj-xij），k=1，…，K;從而，得到“邊差異效應”得分向量為DE=(DE1，DE2，…，DEk)T。將“節(jié)點差異效應”與“邊差異效應”合并為“網(wǎng)絡差異效應”得分向量D=(DVDE)，該向量的協(xié)方差陣為∑=cov(

37、D)=(σpq)（M+K）×（M+K），p,q=1,2，…，(M+K)，(M+K)為網(wǎng)絡中所有“節(jié)點數(shù)”與“邊數(shù)”之和。從而，將“節(jié)點信息”和“邊信息”整合到統(tǒng)計量NetDifM中
　　NetDifM=DTΣ-1D
　　其中，協(xié)方差矩陣∑可表示為分塊矩陣（ΣVΣVEΣVEΣE）,其計算方法如下:1)對于∑V，p,q=1,2，…，M,σpq=∑Nl=1(Yl-Y-)2 cov(Xp，Xq),Xp=(x1p,x2p，…，xNp)

38、;2）對于∑E, p,q=M+1,M+2,…,M+K,σpq=ΣNl=1(Y1-Y-)2cov(Zp，Zq)，Zp=（Xi-X-i）×（Xi-X-j）;3）對于∑VE，p=1，2，…，M，q=M+1，M+2，…，M+Kσpq=∑Nl=1（Y1-Y-）2 cov（Xp，Zq）。
　　由得分檢驗理論推知，在大樣本情況下，在H∶GD=GC成立時，NetDifM服從自由度為M+K的卡方分布，即NetDifM～x2(K+ M)。樣本量較小時

39、也可采用permutation方法進行假設檢驗。
　　(2)統(tǒng)計模擬
　　針對上述統(tǒng)計量，在H0∶GD=GC成立的前提下遍歷不同樣本量（n）以及網(wǎng)絡規(guī)模大小(M=10，20，40; K=21，45，54)，評估其犯第一類錯誤的概率是否穩(wěn)定在給定的檢驗水準α附近。在H0不成立的條件下，設定節(jié)點X=（X1，X2，…，XM）數(shù)據(jù)服從多元正態(tài)分布，模擬如下3種情形，以系統(tǒng)評估統(tǒng)計量的檢驗效能。情形1:兩網(wǎng)絡之間只有節(jié)點水平的差異;情

40、形2:網(wǎng)絡間只有邊（關聯(lián)強度）存在差異;情形3:網(wǎng)絡間同時存在節(jié)點水平與邊（關聯(lián)強度）的差異。
　　特別地，為進一步評價統(tǒng)計量NetDifM對節(jié)點變量分布的穩(wěn)健性，令節(jié)點X=（X1，X2，…，XM）數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，在部分節(jié)點非正態(tài)（隨機選擇部分節(jié)點，令其為指數(shù)分布）和全部節(jié)點非正態(tài)（令全部節(jié)點為指數(shù)分布）兩種情況下，分別就上述3種情形進行了系統(tǒng)的模擬研究。
　　模擬結(jié)果:1）在H0:GD=GC成立的前提下，針對組間網(wǎng)絡對應

41、節(jié)點及邊差異之和所構(gòu)建的非參數(shù)permutation統(tǒng)計量VEWDM、只考慮兩組間邊差異的非參數(shù)permutation統(tǒng)計量Yates'D，和本章所構(gòu)建的卡方分布統(tǒng)計量NetDifM三種方法，模擬結(jié)果表明，在樣本量達到一定程度時三種方法的犯第一類錯誤的概率均穩(wěn)定在給定的檢驗水準（α=0.05）附近（表3.1-表3.2），而卡方分布統(tǒng)計量NetDifM在樣本量相對較小時(n＞200)即表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。2）在H0不成立的條件下，給定單純

42、節(jié)點差異（如μD3-μC3=0.2等）、單純邊差異（如βD35-βC35=-0.2等）和節(jié)點與邊均存在差異（如μD8-μC8=0.2，βD57-βC57=0.2等）時，模擬結(jié)果（圖3.4-圖3.8）顯示，本章所構(gòu)建的統(tǒng)計量NetDifM與統(tǒng)計量VEWDM及Yates'D相比，始終具有最高的檢驗效能。3）特別地，在只存在節(jié)點差異時，正如所期望的那樣，統(tǒng)計量Yates'D失去檢驗效能，而統(tǒng)計量NetDifM仍然具有很高的檢驗效能。4）在節(jié)點

43、數(shù)據(jù)偏離正態(tài)分布時，本章所構(gòu)建的統(tǒng)計量NetDifM仍然具有最高的檢驗效能，表明NetDifM具有良好的穩(wěn)健性。
　　(3)實例分析
　　將所構(gòu)建的無向網(wǎng)絡差異檢驗的統(tǒng)計量NetDifM應用于麻風病致病網(wǎng)絡比較(706例麻風病病例與514例健康對照)，結(jié)果顯示該統(tǒng)計量具有合理性和實用性，分析結(jié)果符合生物學機制。同時，將統(tǒng)計量進一步用于卵巢癌致病通路PI3K-AKT與Notch(C1亞型卵巢癌病人83例，C2-C6亞型168例

44、)的組間比較，也發(fā)現(xiàn)了符合生物學機制的組間差異。
　　結(jié)論:
　　統(tǒng)計量NetDifM不僅具有良好的穩(wěn)定性、檢驗效能和穩(wěn)健性，而且具有較高的實用性，為系統(tǒng)流行病學研究中無向網(wǎng)絡比較提供了良好的統(tǒng)計學檢驗方法。
　　主要創(chuàng)新點:
　　針對無向網(wǎng)絡的特征，采用“節(jié)點信息與邊信息整合得分”的融合策略，構(gòu)建了網(wǎng)絡組間差異比較的統(tǒng)計量NetDifM，為系統(tǒng)流行病學無向網(wǎng)絡比較提供了新方法。
　　三、有向網(wǎng)絡組間差異比

45、較的假設檢驗方法研究（第四章）
　　上述第三章所構(gòu)建的無向網(wǎng)絡比較的統(tǒng)計量NetDifM只注重了節(jié)點差異和邊差異信息，尚未考慮方向信息。然而在系統(tǒng)流行病學網(wǎng)絡比較中，網(wǎng)絡中的方向信息會提供更有價值的致病路徑及暴露（或干預）的作用機制。從而為探討疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸機制，評價干預措施，尋找精準藥物靶點等提供重要依據(jù)。因此，本章將進一步構(gòu)建有向網(wǎng)絡差異比較的假設檢驗方法。其基本思想是:對于有向網(wǎng)絡，網(wǎng)絡差異絕非僅僅是其節(jié)點和邊兩部分差

46、異的簡單合并，還應充分體現(xiàn)網(wǎng)絡拓撲結(jié)構(gòu)所蘊含的方向信息，即調(diào)控網(wǎng)絡內(nèi)“邊”的箭頭指向及“上游節(jié)點”對“下游節(jié)點”的調(diào)控權重。為此，在構(gòu)建有向網(wǎng)絡比較的統(tǒng)計量時，需將網(wǎng)絡“節(jié)點”、“邊”和“方向”差異信息融為一體，將節(jié)點信息、邊信息和方向信息的差值（效應）DV、DE和Dl整合為兩“對比組”間網(wǎng)絡差異（效應）的統(tǒng)計量Diff=（DV∪DE∪D1）。
　　主要結(jié)果:
　　(1)有向網(wǎng)絡組間差異比較的統(tǒng)計量
　　令GD與GC分

47、別表示兩對比組的網(wǎng)絡，V(GD)與E(GD)分別表示GD中的節(jié)點集合與有向邊集合。當原假設H0∶GD=GC成立時，兩組間的對應網(wǎng)絡節(jié)點總體均值相等，即μDi=μCi（i=1，…，M）;同時兩組間各對應邊的強度及方向相同βDk=βCK(k=1，…，K)。用—XDiXDj表示節(jié)點XDi與XDj之間的有向邊XDiβDij→xDj，其中βDij表示XDi對XDj的調(diào)控強度。令VDi表示節(jié)點XDi的子代節(jié)點數(shù)目，將XDi的權重定義為WDi=VDi

48、/∑lev(GD）VD1，其含義為XDi的子代節(jié)點數(shù)占全部節(jié)點子代節(jié)點總數(shù)的比例。令V=V(GD)∪ V(GC)，E=E(GD)∪E(GC)，則，本章構(gòu)建如下有向網(wǎng)絡組間差異比較的檢驗統(tǒng)計量WNES=1/KΣXkeV(1+wDk+wCk/2)((X)Dk-(X)Ck/√var((X)Dk)+var((X)Ck))2+1/MΣ/xixj∈E((β)Dij-(β)Cij/√var((β)Dij)+var(β)Cij)2其中，WDk，(X)D

49、k，(β)Dij分別表示網(wǎng)絡GD中XDi相應的權重、樣本均值以及βDij的估計值;WCk，(X)Ck，(β)Cij分別為網(wǎng)絡GC中相應的變量。需注意的是K與M分別為節(jié)點集V與邊集E的數(shù)目，如果節(jié)點Xk（或邊/XiXj）在GD中存在，但在GC中不存在，則將(X)Ck與其方差（或(β)Cij與其方差）視為0，反之亦然。統(tǒng)計量中采用的加權形式為a+(wdK+wC)/2，也可以替換為1ogb（b+（wdK+wcK/2），其中α與b越小，表示網(wǎng)絡

50、拓撲結(jié)構(gòu)信息（上、下游節(jié)點間的調(diào)控關系）在統(tǒng)計量中占的比重越大。采用permutation方法進行假設檢驗。
　　(2)統(tǒng)計模擬
　　針對上述統(tǒng)計量WNES，在H0:GD=GC成立的前提下，遍歷不同樣本量(n)、網(wǎng)絡規(guī)模大小(M=12，35，K=15，79)以及網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)（箭頭多少及方向），評估統(tǒng)計量犯第一類錯誤的概率是否穩(wěn)定在給定的檢驗水準α附近。在H0不成立的條件下，給定三種網(wǎng)絡方向加權方式（無方向加權、1+（WDk+WD

51、k）/2，log2(2+(wD+ wC)/2)），模擬如下5種情形，以系統(tǒng)評估統(tǒng)計量的檢驗效能。情形1:只有節(jié)點水平的改變;情形2:只有邊強度值的改變;情形3:同時有節(jié)點水平與邊強度值的改變，變化的點為上游節(jié)點;情形4:節(jié)點與邊數(shù)值的改變與情形3相同，變化的點為下游節(jié)點;情形5:網(wǎng)絡中僅有邊方向改變。
　　模擬結(jié)果顯示:1）在H0∶GD=GC成立時，本章所構(gòu)建的統(tǒng)計量WNES在不同網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)以及網(wǎng)絡規(guī)模大小的情況下，犯第一類錯誤的概

52、率均穩(wěn)定在給定的檢驗水準（α=0.05）附近（表4.1），表明該統(tǒng)計量具有良好的穩(wěn)定性。2）在H0不成立的前提下，統(tǒng)計量WNES的檢驗效能模擬結(jié)果（圖4.3-圖4.6）顯示:當只存在網(wǎng)絡節(jié)點差異時（情形1），只包含節(jié)點差異信息的統(tǒng)計量NS與同時包含“節(jié)點信息、邊信息和方向信息”的統(tǒng)計量WNES具有相同的檢驗效能，表明此情形下所構(gòu)建的統(tǒng)計量WNES穩(wěn)健性良好;當只存在網(wǎng)絡邊強度值改變時（情形2），WNES與只包含邊信息的統(tǒng)計量ES相比，其

53、檢驗效能略低，表明此情形下，統(tǒng)計量WNES會受到無效冗余點信息的影響;當同時存在節(jié)點水平與邊強度改變時（情形3與4），WNES的檢驗效能明顯高于NS與ES的檢驗效能;以上結(jié)果表明WNES可以同時檢驗節(jié)點與邊的差異并且檢驗效能足夠高。在情形5，WNES具有足夠高的檢驗效能，表明WNES能夠檢驗網(wǎng)絡中邊方向的改變。模擬結(jié)果還顯示，WNES采用α+（WDk+WCk）/2與logb（b+（WDk+WCk）/2）兩種加權方式時，檢驗效能都高于無加

54、權的統(tǒng)計量檢驗效能，表明這兩種加權方式都能將網(wǎng)絡中上、下游節(jié)點間的位置信息融入到統(tǒng)計量中，提高檢驗效能，進一步說明了對節(jié)點進行加權是必要且合理的。
　　(3)實例分析
　　將所構(gòu)建的有向網(wǎng)絡差異檢驗的統(tǒng)計量WNES應用于基于病例對照設計的肺癌致病網(wǎng)絡、麻風病致病網(wǎng)絡以及急性髓性白血病致病網(wǎng)絡比較，結(jié)果顯示，1) WNES可以檢驗出麻風病相關基因網(wǎng)絡的差異;2）WNES識別出免疫相關的Foxp3、IL-10、Th17與TGF-

55、β在患白血病與正常情況兩種狀態(tài)下調(diào)控網(wǎng)絡的差異;3）WNES發(fā)現(xiàn)Wnt經(jīng)典信號通路中35個基因構(gòu)成的網(wǎng)絡的改變與肺癌的發(fā)生相關（表4.2）。
　　結(jié)論:
　　統(tǒng)計量WNES能夠同時檢驗網(wǎng)絡中節(jié)點與邊強度及其方向的差異，不僅具有良好的穩(wěn)定性、檢驗效能，而且具有較高的實用性，為系統(tǒng)流行病學研究中有向網(wǎng)絡比較提供了高效的新方法。
　　主要創(chuàng)新點:
　　針對有向網(wǎng)絡的“邊的方向性差異”，借助于“生物群體家系譜圖中，后代子

56、孫越多的個體對生物群體的繁衍貢獻越大”的生物學現(xiàn)象，巧妙地定義了網(wǎng)絡內(nèi)上游節(jié)點對下游節(jié)點的調(diào)控權重，構(gòu)建了“節(jié)點”、“邊”和“方向”差異融為一體的有向網(wǎng)絡比較的統(tǒng)計量WNES，提供了有向網(wǎng)絡比較的新方法。
　　四、致病交互網(wǎng)絡篩選策略方法研究及其預測效果評價（第五章）
　　對復雜疾病而言，研究不同對比組（病例組VS對照組、暴露組VS非暴露組、干預組VS非干預組）間各生物標記之間相互關系的差異將有利于揭示潛在致病機制、預測藥物

57、脫靶效應、發(fā)展多靶點抗癌藥物以及評價干預措施作用機制。
　　上述對比分析的實質(zhì)是從復雜致病網(wǎng)絡中篩選出對結(jié)局或干預效果有貢獻的生物標記之間的致病交互子網(wǎng)絡。然而，在復雜疾病致病網(wǎng)絡中，暴露（或干預）以及病因通路上的生物標記之間的作用往往是錯綜復雜的，不僅存在線性效應，還廣泛存在著形式復雜、分布不清的非線性效應。因此，從復雜致病網(wǎng)絡中篩選出對疾病發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸結(jié)局有效應的生物標記線性或非線性交互效應，是闡明復雜疾病致病機制的核心。

58、目前，在生物網(wǎng)絡組間比較中，往往是比較生物標記之間的線性相關差異性，而忽略了廣泛存在的非線性相關差異。此外，多數(shù)方法無法調(diào)整協(xié)變量的混雜效應。
　　為此，本章提出了一種基于聯(lián)合密度估計的高維網(wǎng)絡差異分析方法并將其進一步應用于構(gòu)建疾病的判別預測模型(JDINAC)。其基本思想是:以病例對照設計為例，令Y表示結(jié)局變量，Y=1表示病例組，Y=0表示對照組，fij與gij分別表示兩個生物標記xi與xj在病例組與對照組的聯(lián)合密度，即，((x

59、i，xj)|Y=1)～fij，（（xi，xj）|Y=0）～gij。則，可用ln(fij(xi，xj)/gij(xi，xj)）來表征兩個標記（xi，xj）的交互關聯(lián)性在病例組與對照組之間的差異。JDINAC方法不需要假設生物標記數(shù)據(jù)服從某種已知參數(shù)分布，也不需要假定他們呈線性關系。既可提高網(wǎng)絡差異比較的準確性，又可提高疾病判別預測的準確性。
　　主要結(jié)果:
　　(1)統(tǒng)計模型
　　以病例對照設計為例，假定每個個體均有p個

60、生物標記測量值（例如基因表達水平、甲基化程度等），對于個體l（l=1，2，…，n），定義Y1=｛0l∈class01l∈class1,其第i個標記的測量值為xli。構(gòu)建JDINAC模型如下:logit(P)=α0+sΣs=lαsZs+pΣi=lpΣj＞iβijinfij(xi,xj)/gij(xi,xj),pΣi=lpΣj＞i|βij|≤c,c＞0,其中，Zs(s=1，…，S)表示協(xié)變量（如年齡、性別等），fij與gij分別表示生物標記

61、xi與xj在病例組與對照組的聯(lián)合密度，即，（（xi，xj）|Y=1)～fij，（（xi，xj）|Y=0）～ gij。若βij≠0，表示兩個標記（xi，xj）的關聯(lián)性在病例組與對照組之間存在差異。在高維情況下，生物標記對（xi，xj）的數(shù)目遠大于樣本量，此時利用厶范數(shù)懲罰方法估計β:(β)=argλmin{∑nl=1（（1-Yl）（αTZl+βTΓl)+1n(1+exp(-αTZl-βTΓl)))+λ||β||1｝,其中，λ為懲罰參數(shù),α

62、=(α0，α1，…，αs)T, Zl=(1,Z1，…，Zs)T，β=vec（β)ijj＞i，Γl=vec(lnfj(xi,xj)/gij(xi,xj))j＞i，vec(·)為矩陣拉直算子。JDINAC模型具體算法如下:Step1.將樣本D={(Yl，Xl),l=1，…，n）隨機分成兩部分:D=(D1，D2)。Step2.利用第一部分樣本D1，估計聯(lián)合密度函數(shù)(f)ij(xi，xj)與(g)ij（xi，xj），i，j=1，…，p，j＞i。

63、Step3.利用第二部分樣本D2，擬合基于厶懲罰的logistic回歸模型logit（P）=α0+s∑s=1αsZs十p∑i=lp∑j＞i∞ijln(f)(xi,xj)/(xi,xj),通過交叉驗證選擇最佳懲罰參數(shù)。Step4.將Step1～Step3重復T次，從而得到(β)ij，t與結(jié)局概率(P)t，t=1，2，…，T。Step5.計算(P)=1/TΣTt=1(P)1作為最終結(jié)局概率;計算生物標記對（xi，xj）的權重Wij=∑Tt=

64、1I（(β)ij，t≠0），i，j=1，…，p，j＞i;其中I(·)為示性函數(shù)。
　　(2)統(tǒng)計模擬
　　本章分以下4種情形進行了模擬，情形1與情形2中生物標記之間的關聯(lián)性均為線性相關，情形1設置效應值較大，情形2效應值較小。情形3:生物標記對（xi，xj）在兩組網(wǎng)絡中Pearson相關系數(shù)相同，但其聯(lián)合密度不同。情形4:生物標記之間存在非線性關系。針對以上4種情形，采用真陽性率(TPR)、真陰性率(TNR)以及正確發(fā)現(xiàn)率(

65、TDR)，來評價JDINAC與其他3種方法(DiffCorr,DEDN，cPLR)在網(wǎng)絡差異分析方面的優(yōu)劣。采用ROC曲線與分類錯誤率來比較JDINAC與隨機森林、樸素貝葉斯、oPLR與cPLR的判別分類準確性。模擬結(jié)果顯示:1）在網(wǎng)絡差異分析方面，JDINAC可靠性高，幾乎在所有情形下都具有最高的TPR，TNR與TDR。在4種模擬情形下JDINAC的TDR分別為93.7％，95.6％，88.3％，99.9％，尤其在情形3與情形4明顯高

66、于其它3種方法DiffCorr(81.3％,85％,7.5％,3.8％),DEDN(33.5％,16.5％,2.1％,5％),cPLR(19.8％,25.6％,53.6％，0.7％)，(Table5.1)。這表明JDINAC確實可以檢測出網(wǎng)絡中非線性關系的變化。2）在分類方面，ROC曲線與分類錯判率皆表明JDINAC明顯比其他4種方法(RF, NB，cPLR，oPLR)判別分類更準確（圖5.4，表5.2）。
　　(3)實例分析

67、r>　　實例數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫中114例乳腺癌病人的癌組織以及匹配的正常組織的基因表達數(shù)據(jù)。本研究選取KEGG數(shù)據(jù)庫中癌癥通路列出的373個基因，分析癌組織與正常組織兩組基因網(wǎng)絡的差異。每組隨機選取50個樣本作為預測集，來評價判別分類準確性。結(jié)果顯示:JDINAC檢測出的排序靠前的網(wǎng)絡差異基因?qū)?，與已有實驗結(jié)果相一致，并且選出的大部分關鍵基因節(jié)點也與乳腺癌細胞的發(fā)生、生長或轉(zhuǎn)移密切相關。在判別分類準確性方面，JAINAC與oPLR方

68、法的錯判率為1％，而RF、NB與cPLR的錯判率分別為19％，2％，17％（表5.6），表明JDINAC具有良好的實用性。
　　結(jié)論:
　　本章建立了基于聯(lián)合密度估計的致病交互網(wǎng)絡篩選策略方法，該方法不僅能篩選出網(wǎng)絡中生物標記之間的線性交互效應，而且能篩選出其非線性交互效應。基于所提取的交互效應而構(gòu)建的疾病判別預測模型優(yōu)于傳統(tǒng)的機器學習方法。
　　主要創(chuàng)新點:
　　1)基于非參數(shù)聯(lián)合密度估計，實現(xiàn)了從網(wǎng)絡中篩選出