胰島素樣生長因子1及受體在甲狀腺相關(guān)眼病眼眶脂肪組織中的研究.pdf

1、目的：
　　隨著現(xiàn)代社會環(huán)境、社會人群心理狀態(tài)及生活習(xí)慣的改變，甲狀腺相關(guān)眼病(thyroid-associated ophthalmopathy，TAO)的發(fā)病率呈現(xiàn)一種逐漸上升趨勢。在美國每年大約有37000例新發(fā)病例，每10萬人口年平均約有16例女性和2.9例男性發(fā)病的患者。它是一種與內(nèi)分泌系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)相關(guān)疾病，確切的發(fā)病機(jī)制不清楚，最近研究表明IgG4可能與它也存在一定相關(guān)性。該病多雙眼發(fā)病，以眼球突出、眼瞼腫脹退縮、上

2、瞼遲落、結(jié)膜充血水腫、眼外肌麻痹等為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時可由于眶內(nèi)肌肉組織壓迫視神經(jīng)或眼球過于突出而形成暴露性角膜炎導(dǎo)致失明。從病理學(xué)來看，它主要是由于眶內(nèi)脂肪組織增多和眼外肌肥厚纖維化及炎性病變?yōu)樘攸c(diǎn)。其中眶內(nèi)脂肪組織病變在發(fā)病中占據(jù)了很重要的作用。
　　作為自身免疫性疾病促甲狀腺素受體(thyroid stimulating hormonereceptor，TSHR)多年來被認(rèn)為是TAO自身免疫主要抗原。但對于自身抗原究竟是一

3、種還是多種參與一直沒有定論。在早期的研究中就曾經(jīng)發(fā)現(xiàn)TSHR抗體免疫沉淀復(fù)合物可以有效地作用在胰島素樣生長因子-1受體(insulin-like growth factorreceptor-1，IGF-1R)上，并且認(rèn)為它可能參與了疾病發(fā)展過程。近幾年有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)提出了TSHR/IGF-1R的復(fù)合共同體學(xué)說，他們通過免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)IGF-1Rβ亞單位與TSHR共同存在于Graves'眼病(Graves'ophthalmopathy，

4、GO)患者眼眶成纖維細(xì)胞和甲狀腺上皮細(xì)胞中，加入IGF-1R的拮抗劑后可以明顯抑制GD-IgG的信號傳導(dǎo)作用。后期的動物模型實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)了IGF-1R在TAO的發(fā)病中起了很關(guān)鍵的作用。
　　而作為IGF-1R的配體胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）是組織生長代謝的重要因子，它可以促進(jìn)成纖維組織透明質(zhì)酸鈉及粘多糖的合成，而GO眼眶組織病理改變與粘多糖沉積有直接的關(guān)系。雖然

5、IGF-1主要來源于肝臟組織細(xì)胞但也在其他組織中發(fā)現(xiàn)分泌現(xiàn)象，敲除基因小鼠的實(shí)驗(yàn)里發(fā)現(xiàn)脂肪組織中IGF-1升高明顯，推測脂肪組織也可能分泌IGF-1。在甲狀腺相關(guān)眼病的臨床研究中也發(fā)現(xiàn)疾病組中血清IGF-1較對照組有明顯升高。另外Delu在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲狀腺相關(guān)性眼病患者中成纖維細(xì)胞存在IGF-1自分泌的現(xiàn)象。以上都表明IGF-1R及配體IGF-1可能在TAO發(fā)病中發(fā)揮一定作用。
　　IGF-1自發(fā)現(xiàn)以來就不斷被證實(shí)并認(rèn)為它和與機(jī)體

6、內(nèi)許多組織的增殖生長及分泌功能有密切聯(lián)系。作為與胰島素家族類似的一種蛋白，IGF-1有著與胰島素很多相似的作用。已經(jīng)有研究表明胰島素可以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)，PAI-1在體內(nèi)的主要作用是調(diào)節(jié)組織型纖溶酶原激活(tissue-type plasminogen activator，t-PA)和尿激酶型纖溶酶原激活(urokinase-typ

7、e plasminogen activator，u-PA)兩者之間的代謝平衡，通過影響細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白代謝平衡而改變纖維化過程，這在肺、肝、皮膚等組織纖維化相關(guān)研究中都被證實(shí)。在對TAO患者淚液分析研究中發(fā)現(xiàn)GO組患者淚液中的PAI-1蛋白比Graves'病(Graves' disease，GD)組有明顯的提高，而且與病情的活動程度有一定相關(guān)性。雖然具體相關(guān)機(jī)制還不清楚但這給了我們一些提示:GO患者眼眶組織中有可能存在PAI-1異常

8、分泌的現(xiàn)象。
　　TAO的發(fā)病除了與免疫性自身抗原有著明確的關(guān)系外，體內(nèi)其他一些生理機(jī)制的紊亂和異常也是導(dǎo)致其發(fā)生的重要原因。作為體內(nèi)一種重要內(nèi)在平衡機(jī)制的自噬是一種基因程序性的調(diào)控行為，在組織生長代謝及自我保護(hù)方面起了重要作用。在一般生理情況下它通過降解或重新利用細(xì)胞器及相關(guān)蛋白來維持細(xì)胞自身的代謝平衡;在病理情況下則為細(xì)胞器的自身修復(fù)和再生提供必需的原料。自噬過程與人類很多疾病都關(guān)系緊密，其中也包括我們常見的一些自身免疫性疾病

9、。比如在脫髓鞘和多發(fā)性硬化疾病相關(guān)研究過程中發(fā)現(xiàn)自噬蛋白Atg5在組織中出現(xiàn)了異常高表達(dá)現(xiàn)象。此外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞分化的過程也有自噬活動的參與，在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)分化時通過電鏡可以觀察到自噬小體含量的增加。IGF-1R作為細(xì)胞重要的受體也參與了體內(nèi)一些組織自噬過程。盡管如此，甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病是否與自噬活動有關(guān)還不清楚。
　　本研究是建立在上述研究背景條件下，對眼眶脂肪組織及細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。第一部分首先主要通過對

10、眼眶脂肪組織進(jìn)行IGF-1R蛋白及mRNA檢測，希望了解TAO患者與對照組之間是否存在差異及蛋白分布情況;其次通過對原代眼眶前脂肪細(xì)胞進(jìn)行提取、培養(yǎng)、鑒定后，探討IGF-1對兩組細(xì)胞增殖能力的影響;最后觀察分化過程中IGF-1R變化和IGF-1自分泌情況及脂化作用;第二部分主要是了解TAO患者眼眶脂肪組織中PAI-1是否存在異常表達(dá)及分布情況，在前脂肪細(xì)胞分化過程中探討IGF-1對PAI-1的合成影響及相關(guān)機(jī)制;第三部分是通過對自噬標(biāo)志

11、性LC3蛋白進(jìn)行檢測對比TAO組和對照組患者眼眶脂肪組織中自噬水平變化情況，并探討眼眶前脂肪細(xì)胞分化過程是否存在自噬過程及影響其水平的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:
　　1.應(yīng)用Western Blot和RT-PCR方法對TAO組和對照組的眼眶脂肪組織IGF-1R、PAI-1、LC3進(jìn)行檢測;
　　2.應(yīng)用免疫組化技術(shù)對TAO組和對照組的眼眶脂肪組織冰凍切片行IGF-1R、PAI-1定位及半定量檢測;
　　3.提取眼眶脂

12、肪組織的原代前脂肪細(xì)胞，對其進(jìn)行培養(yǎng)、傳代，利用Pref-1特異性抗體通過流式細(xì)胞儀對前脂肪細(xì)胞細(xì)胞進(jìn)行鑒定及篩選;
　　4.使用CCK8技術(shù)觀察不同濃度IGF-1(0nM，1nM，5nM，10nM，20nM)對眼眶前脂肪細(xì)胞增殖再生能力的影響;
　　5.利用Western Blot技術(shù)觀察眼眶前脂肪細(xì)胞不同分化時間階段LC3、Atg5及分化前后IGF-1R蛋白表達(dá)情況;通過RT-PCR檢測分化后PAI-1、PPARγ、IG

13、F-1的變化情況;
　　6.不同濃度IGF-1(0nM，1nM，5nM，10nM，20nM)作用于分化的TAO前脂肪細(xì)胞組了解LC3、Atg5蛋白表達(dá)情況;通過RT-PCR檢測分化后PAI-1、PPARγ的變化情況;并利用油紅O染色檢測脂肪化程度;
　　7.觀察PI3k抑制劑LY294002、AKT抑制劑MK2206對IGF-1作用下TAO前脂肪細(xì)胞分化時的作用，通過Western Blot檢測LC3、Atg5蛋白表達(dá)的變化

14、情況，同時了解分化后PAI-1、PPARγ的改變情況。
　　結(jié)果:
　　1.Western Blot和免疫組化顯示TAO脂肪組織中IGF-1R、PAI-1蛋白表達(dá)量高于對照組;而LC3蛋白表達(dá)量低于對照組;
　　2.TAO及對照組眼眶前脂肪維細(xì)胞體外分化無明顯差異;
　　3.IGF-1可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞增殖，在TAO組更為明顯;
　　4.TAO組前脂肪細(xì)胞IGF-1R蛋白在分化前后表達(dá)量高于對照組;

15、r>　　5.TAO組前脂肪細(xì)胞分化過程中早期的LC3、Atg5表達(dá)與分化后PAI-1、PPARγmRNA表達(dá)與對照組無明顯差別;而IGF-1 mRNA表達(dá)量在TAO組要高于對照組;
　　6.IGF-1抑制前脂肪細(xì)胞分化過程中LC3、Atg5蛋白表達(dá)，促進(jìn)PAI-1 mRNA、PPARγmRNA的表達(dá);
　　7.IGF-1R通過PI3K/AKT信號傳導(dǎo)通路來調(diào)控前脂肪細(xì)胞分化中PAI-1 mRNA、PPARγmRNA和LC3、

16、Atg5蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.TAO眼眶脂肪組織及脂肪細(xì)胞高表達(dá)IGF-IR，IGF-1可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞增殖和分化;
　　2.TAO眼眶前脂肪細(xì)胞分化過程中IGF-1自分泌明顯增強(qiáng);
　　3.自噬在TAO眼眶脂肪組織中水平較低，前脂肪細(xì)胞體外分化早期階段可見較明顯自噬;
　　4.TAO眼眶脂肪組織表達(dá)較多PAI-1，IGF-1可以促進(jìn)眼眶前脂肪細(xì)胞PAI-1的表達(dá);
　　5.IGF-