當歸多糖調(diào)控骨髓基質(zhì)細胞衰老的機制研究.pdf

1、細胞衰老是機體衰老的基礎(chǔ)，成體干細胞在機體衰老進程中起關(guān)鍵作用。文獻報道生理性老年骨髓功能減退和腫瘤放化療所致病理性骨髓功能抑制其機制均與造血干細胞衰老相關(guān)。造血干細胞的自我更新及增殖分化受骨髓造血誘導微環(huán)境的調(diào)控，骨髓基質(zhì)細胞作為造血誘導微環(huán)境的核心成分，其生理功能與造血干細胞的生理狀態(tài)密切相關(guān)。但迄今為止鮮有實驗數(shù)據(jù)證實生理性衰老以及腫瘤放化療引起骨髓造血微環(huán)境的衰老生物學改變；骨髓造血誘導微環(huán)境的衰老對造血干細胞衰老的影響及其機制

2、，目前也不甚清楚。本研究用D-半乳糖復制衰老大鼠模型，觀察衰老大鼠骨髓基質(zhì)細胞的生物學變化；D-半乳糖體外誘導復制衰老骨髓基質(zhì)細胞模型，建立骨髓基質(zhì)細胞與造血細胞共培養(yǎng)體系，初步觀察衰老骨髓基質(zhì)細胞對造血細胞增殖分化的影響。
　　當歸多糖（angelica sinensis polysaccharide，ASP）是從祖國傳統(tǒng)中藥當歸中分離、提取的有效藥用成份，具有調(diào)控造血、抗輻射損傷、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用。既往研究表明ASP能促

3、進正常造血，對造血細胞和造血基質(zhì)細胞均有正向調(diào)控作用。本研究通過體內(nèi)外衰老模型進一步探討 ASP調(diào)控 BMSCs衰老的作用及其可能的生物學機制，為從骨髓微環(huán)境角度探討ASP調(diào)控造血細胞衰老提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.D-Gal誘導復制衰老大鼠模型，觀察BMSCs的衰老生物學變化及ASP調(diào)控BMSCs衰老的生物學作用:實驗分為4組：對照組：連續(xù)6w頸部皮下注射NS2mL/d；衰老模型組：連續(xù)6w頸部皮下注射D

4、-Gal120mg/（kg·d）；ASP組：連續(xù)6w頸部皮下注射NS2mL/d，第3w開始，腹腔注射ASP200mg/（kg·d）；ASP治療衰老組：連續(xù)6w頸部皮下注射D-Gal120mg/（kg·d），第3w開始，腹腔注射ASP200mg/（kg·d）。藥物注射完畢第2天，處死大鼠，全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs。采用CCK-8法、SA-β-Gal染色、細胞周期分析、Western Blotting觀察衰老生物學指標的變化；酶學比色法測

5、定細胞培養(yǎng)上清液超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；免疫熒光檢測BMSCs內(nèi)活性氧（reactive oxygen specie，ROS）水平；ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中SCF、IL-6含量。
　　2.D-Gal復制BMSCs體外衰老模型，研究ASP調(diào)控BMSCs衰老的生物學機理：無菌條件下取大鼠脛股骨，制備全骨髓細胞懸液，體外培養(yǎng)BMSCs

6、至F3代，進行后續(xù)相關(guān)實驗檢測。實驗分組：對照組：BMSCs常規(guī)培養(yǎng)96h；衰老組：常規(guī)培養(yǎng)體系中加入30mg/mL D-Gal，培養(yǎng)96h；ASP組：常規(guī)培養(yǎng)體系中加入100μg/mL ASP，培養(yǎng)96h；ASP治療衰老組：30mg/mL D-Gal作用BMSCs48h后，加入100μg/mL ASP繼續(xù)培養(yǎng)48h；ASP延緩衰老組：100μg/mL ASP培養(yǎng)48h后，加入30mg/mL D-Gal繼續(xù)培養(yǎng)48h。采用CCK-8法、

7、SA-β-Gal染色、細胞周期分析、Western Blotting觀察衰老生物學指標的變化；酶學比色法測定細胞培養(yǎng)上清液SOD、MDA含量；免疫熒光檢測BMSCs內(nèi)ROS水平； ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清中SCF、IL-1β及GM-CSF含量。
　　3.建立BMSCs與骨髓單個核細胞（bone marrow mononuclear cells，BMNCs）共培養(yǎng)模型，觀察ASP調(diào)控BMSCs衰老對造血細胞增殖分化的影響：同上制

8、備BMSCs飼養(yǎng)層，實驗分為對照組、衰老組、ASP組、ASP抗衰老組。提取BMNCs，分別種植于各組飼養(yǎng)層上，與BMSCs共培養(yǎng)48h。采用CFU-Mix集落半固體培養(yǎng)、CCK-8法、流式細胞周期術(shù)觀察分析造血細胞增殖分化生物學指標。
　　結(jié)果
　　1.衰老大鼠BMSCs增殖能力明顯降低；細胞周期阻滯于G1期；衰老細胞特異性SA-β-Gal染色陽性率明顯增加；衰老相關(guān)蛋白P16、P21、P53表達明顯上調(diào)。BMSCs內(nèi)SOD

9、酶活性降低、MDA及ROS含量升高；細胞分泌SCF、IL-6減少。
　　2.與衰老大鼠BMSCs相比，體內(nèi)注射ASP，可降低衰老大鼠BMSCs SA-β-gal染色陽性率；G1期細胞比例降低、S期細胞比例增加；衰老相關(guān)蛋白P16、P21、P53表達下調(diào)；胞內(nèi)SOD酶活力上升、MDA及ROS水平下降；細胞培養(yǎng)上清SCF、IL-6表達升高。
　　3.ASP體外作用衰老BMSCs，BMSCs增殖能力上升；細胞SA-β-gal染色陽

10、性率降低；G1期細胞比例減少，S期細胞比例增加；P16、P21、P53蛋白表達減弱；ASP提高BMSCs的SOD酶活性，降低MDA、ROS含量。ASP促進BMSCs分泌SCF、IL-1β及GM-CSF。
　　4.與衰老組BMSCs共培養(yǎng)的BMNCs增殖能力下降；細胞周期分布改變，S期細胞減少，G1期細胞增多；多向性造血祖細胞CFU-Mix集落形成數(shù)量顯著性降低；與ASP抗衰老組BMSCs共培養(yǎng)的BMNCs增殖能力較與衰老組BMSC

11、s共培養(yǎng)的BMNCs明顯上升；S期細胞比例升高，G1期細胞比例下降；CFU-Mix集落形成數(shù)量上升。
　　結(jié)論
　　1.衰老大鼠BMSCs發(fā)生衰老生物學改變。
　　2.ASP可延緩衰老大鼠BMSCs衰老。
　　3.ASP延緩BMSCs衰老機制可能與ASP提高骨髓基質(zhì)細胞抗氧化能力，降低細胞內(nèi)活性氧水平，抑制衰老相關(guān)蛋白表達有關(guān)。
　　4.ASP通過延緩BMSCs衰老促進造血細胞增殖分化，其機制可能與ASP降