諾如病毒RT-PCR方法的建立及其江蘇部分地區(qū)的流行病學(xué)研究.pdf

1、諾如病毒(Norovirus，NV)是引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體之一，近年來(lái)由諾如病毒引起的疫情暴發(fā)與流行逐漸增多，日益成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。由于諾如病毒尚不能體外培養(yǎng)，且極易發(fā)生變異，傳統(tǒng)的血清學(xué)及免疫學(xué)檢測(cè)方法存在很大局限性，目前以PCR為核心的分子生物學(xué)檢測(cè)方法成為檢測(cè)諾如病毒的主要研究方向。本研究通過(guò)建立常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)水體樣品的前處理進(jìn)行研究，并運(yùn)用建立的方法對(duì)采集于江蘇部分地區(qū)的臨

2、床、牡蠣和水體樣品進(jìn)行檢測(cè)與評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步完善諾如病毒的檢測(cè)提供依據(jù)。同時(shí)了解江蘇部分地區(qū)諾如病毒的污染狀況，分析其分子流行病學(xué)特征，為諾如病毒的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及分子流行病學(xué)調(diào)查提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　一、諾如病毒常規(guī)RT-PCR與熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及比較
　　針對(duì)諾如病毒衣殼蛋白保守區(qū)及ORF1-ORF2連接處的基因序列設(shè)計(jì)引物、探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。運(yùn)用建立的方法對(duì)

3、其他腸道病毒進(jìn)行檢測(cè)，均無(wú)交叉反應(yīng)，表明該兩種方法具有良好的特異性;不同拷貝數(shù)的諾如病毒檢測(cè)結(jié)果顯示常規(guī)RT-PCR檢測(cè)限為103copies/μL，熒光定量RT-PCR檢測(cè)限為102copies/μL。對(duì)不同稀釋梯度含有GⅠ型、GⅡ型諾如病毒目的基因的標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量RT-PCR反應(yīng)，結(jié)果GⅠ型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在102～108copies/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=40.585-3.301×lgX，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.

4、997，擴(kuò)增效率E仃為100.889％; GⅡ型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在101～108copies/μL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=40.666-3.229×lgX，R2達(dá)到0.996，Eff為104.039％;批內(nèi)變異系數(shù)在0.18％～0.57％之間，批間變異系數(shù)在0.71％～2.62％之間，表明熒光定量RT-PCR具有良好的重復(fù)性。
　　運(yùn)用建立的常規(guī)RT-PCR和熒光定量RT-PCR方法對(duì)22份臨床樣品進(jìn)行同步檢測(cè)，并與南通市疾

5、病預(yù)防控制中心的檢測(cè)結(jié)果相比對(duì)，常規(guī)RT-PCR敏感度、特異度分別為71.43％、100％，符合率達(dá)到90.91％;熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與南通市疾病預(yù)防控制中心完全一致。運(yùn)用建立的兩種方法進(jìn)一步對(duì)180份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其中常規(guī)RT-PCR陽(yáng)性率為5.56％，符合率達(dá)97.22％;熒光定量RT-PCR陽(yáng)性率為8.33％，符合率達(dá)100％;統(tǒng)計(jì)分析兩種方法的檢測(cè)率有顯著性差異(P＜0.05)，并對(duì)陽(yáng)性樣品測(cè)序，結(jié)果證實(shí)均為諾如病

6、毒。
　　二、水中諾如病毒富集方法的建立及優(yōu)化
　　采用國(guó)內(nèi)常見(jiàn)的混合纖維素酯濾膜，對(duì)人為污染諾如病毒的水樣進(jìn)行病毒富集，優(yōu)化濾膜的吸附與洗脫過(guò)程，建立水體病毒富集方法。在吸附過(guò)程中對(duì)水樣pH值、多價(jià)陽(yáng)離子及離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，隨后在洗脫過(guò)程中優(yōu)化洗脫液及其pH值和濃度。研究結(jié)果顯示，在吸附水體病毒過(guò)程中，當(dāng)水樣pH值為3.5時(shí)，病毒平均吸附率為28.96％，吸附效果優(yōu)于其它pH值;向水樣加入Na+、Mg2+、Al3+，三種離

7、子的平均吸附率分別48.42％、28.96％、18.28％，Na+吸附效果優(yōu)于Mg2+和Al3+;當(dāng)水樣中Na+濃度為0.2mol/L時(shí)，濾膜吸附效果較好，平均吸附率高達(dá)72.15％，優(yōu)于Na+其它濃度。在洗脫濾膜過(guò)程中，1％NaPP-PB-甘氨酸-0.5％吐溫80洗脫液較好，平均洗脫率為107.85％，優(yōu)于其它洗脫液;當(dāng)NaPP的濃度為0.5％時(shí)，平均洗脫率高達(dá)119.94％，優(yōu)于其它濃度的洗脫液;洗脫液的pH值為8.5、9.5、10

8、.5、11.5時(shí)，平均洗脫率分別為29.43％、113.54％、134.90％、104.52％，表明當(dāng)洗脫液的pH值為10.5時(shí)，其洗脫效果優(yōu)于其它pH值。
　　運(yùn)用建立的混合纖維素酯膜吸附-洗脫法對(duì)人為污染100～103copies/μL諾如病毒液的待濾水進(jìn)行富集，通過(guò)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)10～103copies/μL諾如病毒的待濾水經(jīng)富集后，均可檢出諾如病毒，未經(jīng)富集的待濾水均未檢出諾如病毒，表明該水樣富集方法的靈敏

9、度為待濾水中病毒量達(dá)10copies/μL。
　　三、江蘇部分地區(qū)諾如病毒分子流行病學(xué)分析
　　在2014年1月～2014年12月間采集揚(yáng)州、南通兩地區(qū)腹瀉病人的臨床樣品648份，揚(yáng)州市翠園橋海鮮農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、歐尚超市的牡蠣樣品136份以及市區(qū)二道河、安敦河和寶帶河中水體樣品60份，用熒光定量RT-PCR方法對(duì)上述樣品進(jìn)行諾如病毒檢測(cè)。結(jié)果顯示648份臨床樣品中，共檢測(cè)出85份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為13.12％。其中，揚(yáng)州地區(qū)陽(yáng)性率

10、為19.13％(57/298)，南通地區(qū)陽(yáng)性率為8％(28/350)，揚(yáng)州地區(qū)諾如病毒的感染率顯著高于南通地區(qū)(P＜0.05);14歲以下兒童感染率為18.04％(57/316)，14歲以上患者感染率為8.06％(22/273)，14歲以下兒童的感染率顯著高于其它人群(P＜0.05);男性感染率為13.01％(38/292)，女性感染率為12.30％(38/309)，男、女感染率差異不顯著(P＞0.05)。136份牡蠣樣品中，檢測(cè)出9份

11、陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率6.62％。其中翠園橋海鮮農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)陽(yáng)性率為7.64％(5/67);歐尚超市陽(yáng)性率為5.80％(4/69)，統(tǒng)計(jì)分析揚(yáng)州市兩個(gè)海鮮銷售市場(chǎng)諾如病毒感染率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。60份水體樣品中，檢測(cè)出13份陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為21.67％。其中二道河水樣陽(yáng)性率為10％(2/20)，安敦河水樣陽(yáng)性率為20％(4/20)，寶帶河水樣陽(yáng)性率為35％(7/20)，統(tǒng)計(jì)分析揚(yáng)州市區(qū)三道河流諾如病毒污染率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

12、
　　基于諾如病毒衣殼蛋白保守區(qū)的基因序列，應(yīng)用MEGA5.0軟件對(duì)43份陽(yáng)性臨床樣品和1份陽(yáng)性水體樣品中諾如病毒進(jìn)行基因分型，檢出GⅠ型諾如病毒2份，包括GⅠ.2、GⅠ.6亞型;GⅡ型諾如病毒42份，包括GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.8、GⅡ.17四種基因亞型。其中GⅡ.4亞型有32份，占所有基因型別的72.73％，并與世界流行株GⅡ.4/2006 variant和GⅡ.4/2010在同一分支上，同源性為97％。1份陽(yáng)性水體樣品中諾