細胞外pH值對超極化激活環(huán)核苷酸門控陽離子通道的調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、背景:目前心腦血管疾病已成為威脅我國人民健康和小康建設(shè)的最主要的公共衛(wèi)生問題。我國每年因心血管疾病包括冠心病和腦卒中的死亡人數(shù)約為150萬。在心肌梗塞患者發(fā)病時，其局部的缺血缺氧會導(dǎo)致局部較嚴重的酸中毒，由于血液循環(huán)障礙時，不利于代謝產(chǎn)物的排出，而且酸中毒時對局部組織的影響也非常大，特別是對冠脈平滑肌和心肌細胞，因而，在臨床上及時的糾正酸中毒將極大的減少了對心梗心肌細胞的損害。揭示酸中毒對心肌細胞損害的機制，將有助于對某些心臟疾病的預(yù)后

2、提供理論基礎(chǔ)。在某些疾病導(dǎo)致機體酸中毒時，會改變心肌的竇性心率，心輸出量減少等癥狀。在正常情況下竇房結(jié)是生理起搏點，控制著心臟的跳動，竇房結(jié)細胞自動除極頻率決定著心率的快慢。參與竇房結(jié)自動除極的離子流目前認為有以下幾種:超極化激活的內(nèi)向陽離子電流If、持續(xù)性內(nèi)向離子流IST、內(nèi)向鈣電流ICa-T、鈉鈣交換電流INa/Ca、延遲整流性鉀電流Ik、背景電流（包括鈉流和鉀流）、D型ICa-L。超極化激活的環(huán)核苷門控離子通道（hyperpola

3、rization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN），目前認為主要有鈉離子和鉀離子流通過，近期有研究發(fā)現(xiàn)還有鈣離子流的成分。HCN通道介導(dǎo)的起搏電流引起竇房結(jié)細胞舒張期去極化，從而在心臟自主搏動及心律的調(diào)節(jié)等方面起重要的生理作用。體內(nèi)HCN通道在心臟起博細胞中呈高表達，參與心臟起博的產(chǎn)生及心率調(diào)控。有實驗表明，在機體酸中毒時，心率是減慢的，但是對HCN通道的功能變化尚不明確。HC

4、N通道包括四個亞基，其中心臟中包括3個亞基(HCN1，HCN2，HCN4)，這三個亞基在心臟中有可能是同聚體或者是異聚體，為了揭示細胞外不同PH值對HCN通道不同亞基的影響，本實驗利用爪蟾卵母細胞建立表達HCN通道不同亞基的同聚體及異聚體表達模型，來觀察細胞外酸性液對HCN通道不同亞基同聚體或者是異聚體通道電流的影響。
　　目的:建立爪蟾卵母細胞表達的HCN通道同聚體或者異聚體的細胞模型，觀察不同PH酸性液對HCN通道電流的影響。

5、
　　方法:將HCN1、HCN2的cDNA體外轉(zhuǎn)錄為cRNA后，分別注射至去除濾泡膜的非洲爪蟾卵母細胞中，表達1-3天后使用雙電極電壓鉗技術(shù)記錄HCN通道電流，非選擇性阻斷劑CsCl可將其完全阻斷，成功建立了爪蟾卵母細胞表達的HCN通道細胞模型，使用不同PH酸性液觀察對HCN通道同聚體及異聚體電流的影響。
　　結(jié)果:在爪蟾卵母細胞表達的HCN1及HCN2通道的同聚體細胞模型上，記錄到了超極化激活的內(nèi)向陽離子電流，可被非選擇性

6、阻斷劑CsC1所阻斷。在1mmol/L的CsCl作用下，HCN通道產(chǎn)生的電流顯著減小，在-140mV水平，HCN1電流值減少率為83.4％±9.5％(n=5，P＜0.001);HCN2產(chǎn)生的電流減少率為99.7％±0.6％(n=4，P＜0.001)。TRIP8b是HCN1的輔助亞基，可使HCN1的電流幅度顯著增大。與HCN1組相比，HCN1的mRNAs稀釋4倍后等比例與輔助亞基TRIP8b注入細胞后，其電流幅度仍明顯增大，且HCN1+T

7、RIP8b組電流幅度的增大有統(tǒng)計學(xué)意義。在不同pH酸性液作用下，HCN1及HCN2同聚體和異聚體通道電流被抑制，且其電流幅度隨pH值的降低而減小。在-140mV水平，從pH6.5至pH5.0，HCN1電流值減少率為24.6％±8.1％(n=6，P＜0.001);HCN2產(chǎn)生的電流減少率為25.6％±6.8％(n=4，P＜0.01);HCN1+HCN2的電流減少率為21.3％±6.5％(n=4，P＜0.001);在不同pH堿性液作用下，H

8、CN1及HCN2同聚體和異聚體通道電流幅度改變并無統(tǒng)計學(xué)意義。在-140 mV水平，從pH7.5至pH8.0時， HCN1電流減少率為1.9％±0.1％(n=3，P＞0.05);HCN1+HCN2異聚體電流減少率為5.6％±2.0％(n=3，P＞0.05)。
　　結(jié)論:1.HCN1及HCN2的同聚體和異聚體通道能夠在爪蟾卵母細胞中成功表達;2.在不同pH值的酸性液中HCN1及HCN2的同聚體和異聚體通道電流幅度隨pH值的降低而減小