骨癌痛模型酸感受離子通道表達變化和SDF-1對鈉離子通道電流調(diào)節(jié)機制的研究.pdf

1、研究一大鼠骨癌痛模型的建立及酸感受離子通道(ASIC)亞基的表達
　　目的:通過建立大鼠骨癌痛模型并研究其背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上ASIC亞基mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化，來探索ASIC亞基在骨癌痛發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:Sprague-Dawley大鼠45只隨機分為三組:假手術(shù)組(sham，n=15)，骨癌痛模型7天組(C7，n=15)，骨癌痛模型14天組(C14，n=15)。三組大鼠分別于左后肢脛骨上段髓腔內(nèi)注射5μL

2、生理鹽水(sham組)或1×104/μL walker256鼠源性乳腺癌細胞生理鹽水懸浮液(C7組和C14組)，建立癌痛模型。術(shù)后密切觀察大鼠健康狀況，用Von Frey filament(VFF)細絲和CO2激光熱刺激儀測量大鼠左下肢機械痛敏縮足閾值(PWT)和熱痛敏PWT的變化。分別于術(shù)后7天和14天對大鼠進行行microCT影像學(xué)檢查和HE病理學(xué)檢查，以確定腫瘤對脛骨的破壞情況。在各組觀察期結(jié)束時，分別取腰4、腰5(L4、L5)D

3、RG。RT-PCR，免疫印跡和免疫熒光分別用來檢測DRG上ASIC的mRNA和蛋白質(zhì)的表達變化。
　　結(jié)果:與sham組大鼠相比，C7、C14術(shù)側(cè)下肢機械痛敏PWT和熱痛敏PWT明顯下降。Micro CT圖像表明，C7組脛骨破壞不明顯，C14組有明顯的骨質(zhì)破壞，甚至有骨皮質(zhì)的缺損。與假手術(shù)組相比較，在六個ASIC亞基中，只有C14組同側(cè)的ASIC3亞基的mRNA表達升高。但是在蛋白表達方面，除了ASIC2a，同側(cè)的ASIC1，AS

4、IC3，ASIC4亞基蛋白都不同程度的表達升高。免疫雙標的方法檢測到與假手術(shù)組相比較，C14組手術(shù)中ASIC3和異凝集素-B4(IB4)共表達的神經(jīng)元的數(shù)目更多。另外，也發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比較，C14組中ASIC3和neurofilament200(NF200)共同表達的DRG神經(jīng)元更多。
　　結(jié)論:大鼠脛骨內(nèi)注射Walker256細胞可以成功復(fù)制骨癌痛模型。大鼠脊髓左側(cè)L4、L5 DRG上ASIC3的mRNA和蛋白質(zhì)的表達量明顯增

5、高，提示ASIC3亞基可能在骨癌痛的發(fā)生發(fā)展中有一定作用。
　　研究二 SDF-1及其下游信號通路對于Nav1.8電流的調(diào)節(jié)作用
　　目的:趨化因子作為一種新的神經(jīng)調(diào)質(zhì)參與脊髓水平和脊髓上水平的疼痛感知過程。Stromal cell-derived factor1(SDF-1)，又名chemokine CXC motif ligand12(CXCL12)，在慢性疼痛模型動物的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上的表達升高。但是SDF-1對

6、于河豚毒素不敏感(TTXR)鈉通道Nav1.8電流變化的作用機制尚未得到研究。本文就是利用電生理學(xué)的方法研究SDF-1及其受體CXCR4對于Nav1.8鈉離子通道的調(diào)控作用。
　　方法:免疫熒光的方法用來檢測Nav1.8和CXCR4在DRG神經(jīng)元上的共分布。急性分離培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元和不同濃度的SDF-1(5，25，50，200，400 ng/mL)進行孵育1-2小時。全細胞電壓鉗記錄空白對照組和不同濃度SDF-1孵育組DRG神經(jīng)

7、元上的Nav1.8電流的變化，以觀察SDF-1對Nav1.8電流的影響。隨后，全細胞電壓鉗技術(shù)記錄CXCR4受體抑制劑AMD3100、G蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)和霍亂毒素(CTX)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002對于Nav1.8電流的影響。
　　結(jié)果:利用免疫熒光的方法，實驗發(fā)現(xiàn)42％的DRG神經(jīng)元是CXCR4蛋白和Nav1.8鈉離子通道蛋白共同表達的。SDF-1預(yù)處理急性分離的小直徑的DRG神經(jīng)元，會記錄

8、到神經(jīng)元上Nav1.8電流幅度呈現(xiàn)SDF-1濃度依賴性的增高。SDF-1也使得Nav1.8電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化的方向發(fā)展。實驗中所用的抑制劑(AMD3100，PTX，CTX，LY294002)都會不同程度的增加Nav1.8電流。另外用這些抑制劑預(yù)處理背根神經(jīng)節(jié)也會使Nav1.8的穩(wěn)態(tài)激活曲線向著超極化的方向轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:SDF-1可以增加Nav1.8電流來興奮初級傷害性感受神經(jīng)元，但是SDF-1對Nav1.8的調(diào)節(jié)可能并

9、不是通過CXCR4及其下游的G蛋白和PI3K信號通路。
　　研究三 SDF-1及其下游信號通路對于Nav1.9電流的調(diào)節(jié)作用
　　目的:研究表明趨化因子是小分子蛋白的細胞因子超家族，它們在免疫和神經(jīng)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。Stromal cell-derived factor1(SDF-1)，又名chemokine CXCmotif ligand12(CXCL12)，在慢性疼痛模型動物的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)上的表達升高。但是S

10、DF-1引起TTXR鈉離子電流Nav1.9電流發(fā)生變化的機制尚未得到研究。本實驗利用電生理學(xué)的方法研究SDF-1及其受體CXCR4對于Nav1.9鈉離子通道的調(diào)控作用。
　　方法:免疫熒光的方法用來檢測Nav1.9和CXCR4在DRG神經(jīng)元上的共表達。急性分離的DRG神經(jīng)元和不同濃度的SDF-1(5，25，50，200，400 ng/mL)進行孵育1-2小時。全細胞電壓鉗記錄空白對照組和SDF-1孵育組DRG神經(jīng)元上的Nav1.9

11、電流的變化，以觀察SDF-1對Nav1.9電流的影響。同時，全細胞電壓鉗技術(shù)也記錄了CXCR4受體抑制劑AMD3100、G蛋白抑制劑百日咳毒素(PTX)和霍亂毒素(CTX)、磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY294002對于Nav1.9電流的影響。
　　結(jié)果:利用免疫熒光的方法，實驗中發(fā)現(xiàn)37％的DRG神經(jīng)元是CXCR4蛋白和Nav1.9鈉離子通道蛋白共同表達的。研究中也發(fā)現(xiàn)，SDF-1預(yù)處理急性分離的小直徑DRG神經(jīng)元，可以記

12、錄到神經(jīng)元上Nav1.9電流幅度呈現(xiàn)SDF-1濃度依賴性的增高。SDF-1也使得Nav1.9電流的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化的方向發(fā)展。對于Nav1.9通道來說，CXCR4受體抑制劑AMD3100可以阻斷SDF-1引起的Nav1.9電流密度和通道動力學(xué)特性的改變。PTX而不是CTX可以阻斷SDF-1引起的Nav1.9電流的增加，這表明Gi/o蛋白亞基參與SDF-1對于Nav1.9鈉通道電流的調(diào)節(jié)。另外，磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制劑LY29