兩種蜻蜓腸道菌的分離鑒定及代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、昆蟲共生菌是一類長期與昆蟲共進(jìn)化的微生物，具有非常豐富的物種多樣性及代謝途徑多樣性。昆蟲腸道菌是昆蟲共生菌中的一種。目前已有的報道證實(shí)，昆蟲腸道菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性顯著的天然產(chǎn)物，而且從多種昆蟲腸道菌中分離鑒定了許多微生物新種，可能是人類重要的微生物資源。
　　本文以蜻蜓目中黃蜻幼蟲和豆娘為研究對象，利用可培養(yǎng)方法、形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)手段，對黃蜻腸道共生真菌的多樣性性進(jìn)行了分析，利用PCR擴(kuò)增及激光共聚焦顯微鏡對真菌內(nèi)共生細(xì)菌進(jìn)

2、行了初步分析，對1株豆娘腸道真菌進(jìn)行了分離與鑒定。結(jié)合粗提物活性測試結(jié)果，對其中2株黃蜻腸道真菌（QTYC11與QTYC1）及1株豆娘腸道真菌(DN02)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了進(jìn)一步研究，采用多種色譜分離技術(shù)（硅膠柱層析、LH-20葡聚糖凝膠柱層析、反相柱層析、HPLC等）對代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，綜合運(yùn)用多種波譜技術(shù)（1H-NMR，13C-NMR，HMQC，COSY，HMBC以及ESI-MS等）鑒定代謝物結(jié)構(gòu)。共分離得到12個單體化合物，鑒定了1

3、1個化合物，其中1個單體化合物為新化合物，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了單體化合物的除草和抗菌等生物活性。分述如下:
　　1、對黃蜻幼蟲腸道真菌多樣性進(jìn)行了初步的研究。利用稀釋平板法對腸道內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，結(jié)合真菌內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)測序分析的方法對真菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果共得到48株腸道真菌，分屬于4大類，11種不同屬，其中包括1株新菌種。以真菌的基因組DNA為模板，以27F，1492R為引物進(jìn)行16S rDNA序列擴(kuò)增，在48株菌種中共獲得有14株細(xì)

4、菌(14/48)的16S DNA序列。測序結(jié)果表明大多數(shù)細(xì)菌屬于變形菌(13/14)，另外還包括1株芽孢桿菌(1/14)，其中Leclercia sp.，Oceanobacillus.oncorhynchi和Methylobacterium.extorquens作為真菌內(nèi)共生細(xì)菌為首次報道。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用激光顯微鏡，對生存在真菌活菌絲內(nèi)的共生細(xì)菌進(jìn)行SYTO9熒光染色，通過觀測發(fā)現(xiàn)在QTYC45真菌中確實(shí)存在內(nèi)生細(xì)菌。采用濾紙片擴(kuò)

5、散法測定了真菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌(ATCC8739)，枯草芽孢桿菌(ATCC6633)和金黃色葡萄球菌(ATCC6538)的抗菌活性，48株真菌中近50％的菌株具有良好的抗菌效果。進(jìn)一步研究表明分離得到的新菌株QTYC44具有很好的纖維素酶活性，發(fā)酵6d后的發(fā)酵液纖維素酶活可達(dá)到1654.6 U/mL。本研究首次報道了黃蜻幼蟲腸道真菌的多樣性及其抗菌活性，結(jié)果表明，黃蜻幼蟲腸道內(nèi)生真菌不僅具有豐富的多樣性也是生物活性物質(zhì)的重要潛在來源。

6、
　　2、對黃蜻幼蟲腸道共生真菌Paraphaeosphaeria sp.QTYC11的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離與鑒定。從QTYC11中分離得到10個化合物，鑒定了其中9個化合物(1-9)，包括1個新化合物lunatoic acid C(1)?；钚詼y試結(jié)果表明:化合物1和6對反枝莧（Amaranthus retroflexus）具有很好的抑制活性，其IC50分別為10.2和27.6μg/mL;代謝物1和4對稗草（Echinochlo

7、a crusgalli）具有很好的抑制活性，其IC50分別為5.9和16.0μg/mL;盆栽實(shí)驗(yàn)表明化合物1可以很好的抑制稗草幼苗的生長，可以降低幼苗46.0％干重?？拐婢钚詫?shí)驗(yàn)表明化合物1對蘋果腐爛病菌(Valsa mali, IC50=3.3μg/mL)，小麥赤霉病菌(Gibberella sanbinetti, IC50=1.7μg/mL)和黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum，IC5

8、0=4.2μg/mL)具有很好的抑制活性，與陽性對照放線菌酮活性相當(dāng)。此外化合物1也顯示了良好的抗細(xì)菌活性，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑菌圈分別為17.1和28.3 mm。
　　3、對黃蜻幼蟲腸道共生真菌Curvularia crepinii QTYC-1的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離與鑒定。離體活性測試發(fā)現(xiàn)C.crepinii QTYC-1發(fā)酵液可顯著抑制稗草和反枝莧幼根的生長，其最大抑制率分別可達(dá)95.0％和90.1％，并可使

9、經(jīng)噴施發(fā)酵液的稗草幼苗的受害率達(dá)到71.1％。發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對稗草和反枝莧幼根具有很好的抑制效果，在100μg/mL的濃度條件下，粗提物對稗草和反枝莧的抑制活性分別為56.8％和71.2％，且在該濃度條件下其對一些常見農(nóng)作物具有很好的安全性，其抑制率均低于35％。發(fā)酵液的乙酸乙酯提取物對楊樹潰瘍病菌（Dothiorella gregaria）、番茄早疫病菌（Altemariasolani）、苦瓜枯萎病菌（Fusarium.oxy

10、sporum f.sp.mornordicae）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium.oxysporumf.sp.cucumerinu）、小麥赤霉病菌(Gibberella sanbinetti)也具有很強(qiáng)的抑制作用，在25μg/mL濃度下，抑制率分別為69.0％、86.3％、46.6％、74.3％和71.2％，與陽性對照放線菌酮的活性相當(dāng)。進(jìn)一步從其乙酸乙酯提取物中分離得到化合物(5Z)-7-oxozeaenol(11)，活性測試表明，在

11、100μg/mL的濃度條件下，化合物11對稗草和反枝莧的抑制活性分別為56.8％和71.2％。
　　4、對豆娘幼蟲腸道共生真菌Cochliobolus lunatus DN02的活性代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離與鑒定。測試結(jié)果表明DN02乙酸乙酯粗提物對稗草和反枝莧具有較強(qiáng)的抑制活性，對幼根抑制活性的IC50分別為22.9μg/mL和136.7 pg/mL;當(dāng)噴施發(fā)酵液原液時，稗草受害率、平均株高、平均鮮重分別為66.7％、5.2 cm、1