循環(huán)miRNA及miR-31對(duì)原發(fā)性高血壓左室肥厚的影響.pdf

1、第一部分原發(fā)性高血壓左室肥厚患者循環(huán)miRNA的特異性表達(dá)
　　目的：探討原發(fā)性高血壓左室肥厚患者循環(huán)miRNA的特異性表達(dá)變化，為高血壓左室肥厚的診斷和預(yù)測(cè)尋找新的生物學(xué)標(biāo)志。
　　方法：入選原發(fā)性高血壓合并左室肥厚及原發(fā)性高血壓不合并左室肥厚患者各5例，采集患者血漿標(biāo)本并進(jìn)行miRNA提取，通過高通量二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)兩組患者循環(huán) miRNA表達(dá)變化，對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析篩選出差異性表達(dá) miRNA，進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析

2、差異表達(dá)miRNA的靶基因并進(jìn)行功能富集分析，初步探討差異表達(dá)miRNA的功能。
　　結(jié)果：篩選出原發(fā)性高血壓左室肥厚患者差異化特異性表達(dá)miRNA共64個(gè)，其中35個(gè)表達(dá)上調(diào)，29個(gè)表達(dá)下調(diào)；生物信息學(xué)分析顯示差異性表達(dá)miRNA的功能主要涉及心肌細(xì)胞腎上腺素信號(hào)、神經(jīng)活化配體/受體相互作用、免疫炎癥反應(yīng)、脂肪酸代謝等與高血壓左室肥厚密切相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控，其中hsa-mir-100、hsa-mir-202、hsa-mir-18

3、1a-2、hsa-mir-450b富集的功能最為顯著。結(jié)論：原發(fā)性高血壓左室肥厚患者外周循環(huán)中存在特異性miRNA表達(dá)譜，可為原發(fā)性高血壓左室肥厚的診斷和預(yù)測(cè)提供候選生物學(xué)標(biāo)志。
　　第二部分miR-31與LATS2在肥大心肌細(xì)胞中的表達(dá)變化
　　目的：觀察心肌細(xì)胞肥大過程中miR-31與LATS2的表達(dá)變化，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　方法：體外培養(yǎng)原代大鼠心肌細(xì)胞，給予10-6 mol/LAngII刺激構(gòu)建體外心肌細(xì)

4、胞肥大模型，qRT-PCR檢測(cè)心肌肥大基因ANP、β-MHC表達(dá)，心肌細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白熒光探針染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)的變化，以確認(rèn)心肌細(xì)胞肥大模型。qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大過程中miR-31與LATS2的表達(dá)變化，Western blot進(jìn)一步檢測(cè)LATS2蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：給予10-6 mol/LAngII刺激成功構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型，干預(yù)2天后即可檢測(cè)到心肌細(xì)胞肥大基因ANP、β-MHC表達(dá)上調(diào)，干預(yù)4天后心肌細(xì)胞熒

5、光染色顯示心肌細(xì)胞表面積明顯增大。伴隨心肌細(xì)胞的肥大變化，miR-31表達(dá)顯著上調(diào)，而LATS2在基因及蛋白水平均明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：給予AngII刺激可成功構(gòu)建心肌細(xì)胞肥大模型；伴隨心肌細(xì)胞的肥大變化， miR-31表達(dá)顯著上調(diào)，而LATS2在基因及蛋白水平均明顯下調(diào)。
　　第三部分miR-31對(duì)LATS2及心肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用
　　目的：通過下調(diào)肥大心肌細(xì)胞中miR-31的表達(dá)，觀察miR-31對(duì)LATS2及心

6、肌細(xì)胞肥大的調(diào)控作用
　　方法：構(gòu)建miR-31抑制物慢病毒載體(LV-miR-31-inhibitor)，體外感染心肌細(xì)胞肥大模型，qRT-PCR檢測(cè)肥大基因ANP、β-MHC表達(dá)，心肌細(xì)胞F肌動(dòng)蛋白熒光探針染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)的變化，監(jiān)測(cè)心肌細(xì)胞肥大的演變。qRT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞肥大演變過程中 LATS2的表達(dá)變化，Western blot進(jìn)一步檢測(cè)LATS2蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：LV-miR-31-inhibi

7、tor感染心肌細(xì)胞肥大模型可大幅下調(diào)miR-31表達(dá)水平，并可促使心肌細(xì)胞肥大基因 ANP、β-MHC表達(dá)下調(diào)，同時(shí)心肌細(xì)胞熒光染色顯示細(xì)胞表面積明顯減?。话殡S心肌細(xì)胞肥大的演變，LATS2在基因水平略有上調(diào)但無顯著差異，而蛋白水平表達(dá)卻明顯增加。
　　結(jié)論：下調(diào)肥大心肌細(xì)胞miR-31表達(dá)水平可一定程度逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞肥大，miR-31可能通過作用于LATS2調(diào)控心肌細(xì)胞肥大的發(fā)生。
　　第四部分miR-31對(duì)LATS2的靶向

8、調(diào)控作用
　　目的：驗(yàn)證miR-31對(duì)LATS2的直接靶向調(diào)控作用。
　　方法：采用雙螢光素酶質(zhì)粒作為工具載體，分別插入 LATS2-3' UTR野生型（LATS2-3' UTR）及突變型（LATS2-3' UTR-MU）基因片段，構(gòu)建LATS2-3' UTR及LATS2-3' UTR-MU雙螢光素酶基因報(bào)告載體。將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒及雙螢光素酶空載質(zhì)粒（LATS2-3' UTR-NC）與miR-3l過表達(dá)質(zhì)粒及miR-3l空