用于生物傳感器的氧化還原酶蛋白固定化技術(shù)研究.pdf

1、生物大分子如何被持久、高效并保持活性狀態(tài)固定在生物傳感表面,同時保證生化反應(yīng)信號迅速而充分地被信號轉(zhuǎn)換元件所采集,是生物傳感器研究的重要課題。氧化還原酶類催化底物分子的氧化還原反應(yīng),反應(yīng)過程中轉(zhuǎn)移的電子可被電化學(xué)檢測儀器捕獲,或者產(chǎn)生顏色變化可通過紫外-可見分光光度計來檢測,易于獲得可定量測定的信號變化,因而適合充當(dāng)生物傳感器的分子識別元件,并作為量化評價酶固定化效果的模式分子。
　　 本論文選擇三種在生物傳感器中廣泛應(yīng)用的氧化

2、還原酶蛋白:膽堿氧化酶(ChOx)、葡萄糖氧化酶(Gox)和辣根過氧化物酶(HRP)來研究兩類蛋白質(zhì)固定化技術(shù),分別為疏水蛋白自組裝薄膜固定化ChOx和Gox,以及聚電解質(zhì)層層累積微膠囊固定化HRP。
　　 疏水蛋白是一類由絲狀真菌產(chǎn)生的外分泌蛋白,包含約100個氨基酸殘基。其分子的表面結(jié)構(gòu)包括一個4 nm2大小的平整的連續(xù)疏水區(qū)域,其余部分為親水性,是一個典型的兩親性分子,具有極強的界面活性,能夠顯著降低水的表面張力,并在多種

3、表面自組裝形成高度有序的納米級結(jié)構(gòu)薄膜,同時改變表面對水的濕潤性,幫助真菌在多種環(huán)境條件下完成表面吸附或沖破水面生長。根據(jù)氨基酸序列疏水模式及蛋白質(zhì)生物物理特點的差異,疏水蛋白分為Ⅰ型和Ⅱ型,本論文研究了來源于瑞氏木霉Trichoderma reesei的Ⅱ型疏水蛋白HFBI在金屬表面的自組裝行為,及其用作電流型生物傳感器的酶固定化基質(zhì)的可行性,致力于構(gòu)建完全由蛋白質(zhì)修飾、能夠最大程度利用固定化酶的催化活力的酶電極。
　　 石英

4、晶體微天平(QCM)實驗結(jié)果證實了HFBI在鉑表面的自組裝行為,并顯示HFBI自組裝量受酸堿度影響不明顯,而隨HFBI濃度增加呈非線性增長。通過循環(huán)伏安法檢測鉑電極表面HFBI自組裝薄膜的通透性,驗證了QCM實驗結(jié)果,即濃度較高的HFBI溶液能夠在鉑表面自組裝形成更為致密的疏水蛋白薄膜,表現(xiàn)為較高的蛋白質(zhì)自組裝量和較低的通透性。篩選出了適于構(gòu)建生物傳感器的適當(dāng)HFBI濃度,由20μg/mL HFBI自組裝形成的疏水蛋白薄膜,能夠允許信號

5、分子過氧化氫通過,同時有效屏蔽電活性干擾物質(zhì)抗壞血酸、尿酸和醋氨酚到達電極表面。
　　 在生物傳感表面構(gòu)造親水性微環(huán)境有利于酶蛋白保持活性構(gòu)象,通過測定HFBI自組裝薄膜修飾前后金表面與水的接觸角變化,證明該薄膜能夠顯著而且穩(wěn)定地提高金表面的親水性。在HFBI自組裝薄膜修飾的金表面通過物理吸附成功地固定化了ChOx,酶的表面覆蓋率為3366 ng·cm-2,固定化后ChOx的最適pH值由游離酶的pH8.0轉(zhuǎn)變?yōu)閜H7.6,表觀米

6、氏常數(shù).Kmapp為1.27 mM,與游離酶Km值接近。在+400 mV工作電位下,基于Au/HFBI/ChOx電極的膽堿生物傳感器各項性能指標良好,最低檢測限為0.01 mM(信噪比=3),線性范圍0.01-1.0mM,靈敏度2184.06458 nA·mM-1,表現(xiàn)出抗干擾性能和較長的使用壽命,對酶活力的利用效率顯著優(yōu)于已報道的同類膽堿生物傳感器。
　　 在HFBI自組裝薄膜修飾的鉑表面通過靜電吸附成功固定化了Gox,酶的表

7、面覆蓋率為859 ng·cm-2,固定化后Gox的表觀米氏常數(shù)Kmapp等于14.8 mM,略低于游離酶Km值。在+400 mV工作電位下,基于Pt/HFBI/Gox電極的葡萄糖生物傳感器各項性能指標良好,最低檢測限為0.12 mM(信噪比=3),線性范圍0.5-20 mM,靈敏度0.29806μA·mM-1,表現(xiàn)出抗干擾性能和較長的使用壽命,對酶活力的利用效率顯著優(yōu)于已報道的同類葡萄糖生物傳感器。
　　 本論文首次將Ⅱ型疏水蛋

8、白應(yīng)用于電流型生物傳感器,獲得了高性能的膽堿和葡萄糖生物傳感器,并提供了兩種基于疏水蛋白HFBI自組裝薄膜的、簡單高效的酶蛋白固定化策略。
　　 本論文還報道了一種操作流程簡化、條件溫和、能夠穩(wěn)定固定化酶蛋白的微膠囊制備技術(shù)。使用包含HRP并帶有負電荷的碳酸鈣微粒作為模板,通過帶有相反電荷的兩種聚電解質(zhì):聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)和聚苯乙烯磺酸鈉(PSS)交替累積,在模板表面形成(PAH/PSS)5自組裝薄膜,溶解模板后獲得了形