WWC3通過下調(diào)Snail和N-cadher in，上調(diào)E-cadher in抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移.pdf

1、前言:近年來肺癌的發(fā)病率及死亡率已位列各種惡性腫瘤之首，80％左右的死因?yàn)榍忠u和轉(zhuǎn)移。因此揭示肺癌侵襲與轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的肺癌生物學(xué)行為的標(biāo)記物，不僅對肺癌的預(yù)后評估大有益處，而且也能為開發(fā)出有效的靶向治療藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。
　　WWCs(WW and C2 domain containing)蛋白家族被認(rèn)為是Hippo通路的上游激活因子，人類WWCs蛋白家族(WWC1，WWC2，WWC3)分子雖然

2、來源于不同的染色體，但在分子結(jié)構(gòu)上有高度的保守性。目前，有關(guān)WWCs家族在人類腫瘤中的作用報(bào)道較少，且僅限于對WWCl的研究上。有報(bào)道指出在人胚腎細(xì)胞中WWC1單獨(dú)或與其他分子(NF2，Willin，PTPN)共同激活Lats1激酶作用，也有報(bào)道指出在乳腺癌細(xì)胞中WWC1不依賴于MST激酶引起Lats1磷酸化水平增加，激活Hippo通路，同時(shí)抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減弱癌細(xì)胞增殖能力，認(rèn)為WWC1為抑癌因子。然而，日本學(xué)者Yohei

3、 Yoshihama等在胃癌的研究中卻發(fā)現(xiàn)WWC1為高表達(dá)和aPKC的低表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后呈正相關(guān)。這些結(jié)果說明了WWCs蛋白家族在人類腫瘤中的作用是復(fù)雜的，許多深入的作用機(jī)制尚待被揭示。而WWC2和WWC3與人類腫瘤的關(guān)系未見報(bào)道。
　　在本文中，我們探究WWCs蛋白家族在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系，以及WWCs與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin有無關(guān)聯(lián)。為尋找非小細(xì)胞肺癌的

4、生物標(biāo)記物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　材料和方法:
　　1、組織來源
　　159例非小細(xì)胞肺癌標(biāo)本均來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院病理科存檔蠟塊。術(shù)前均未接受化療或放射治療。其中男性為92例，女性為67例，平均年齡是60歲。根據(jù)WHO2015肺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn):腺癌93例，鱗癌66例。根據(jù)2009年國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期87例，Ⅱ-Ⅲ期72例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例。以40例正常肺組織作對照。

5、>　　2、免疫組織化學(xué)染色
　　所有的組織均經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋后，制成4微米厚度的切片。采用S-P免疫組化法進(jìn)行染色。一抗使用多克隆兔源性的WWC1抗體(1∶400，Sigma)，WWC2抗體(1∶400，Sigma)，WWC3抗體(1∶400，Sigma)，E-cadherin抗體(1∶100，中杉金橋），N-cadherin抗體(1∶100，中杉金橋)4度孵育過夜。以PBS代替一抗作為空白對照。生物素標(biāo)記的二抗(Ultr

6、asensitive; MaiXin，F(xiàn)uzhou，China)37℃孵育30分鐘，DAB顯色。兩名病理診斷醫(yī)師分別對組織切片染色情況進(jìn)行評分。結(jié)果判定:0分（無著色），1分(1-25％)，2分(26-50％)，3分(51-75％)，4分（76％以上）。再根據(jù)細(xì)胞著色的強(qiáng)度，各指標(biāo)蛋白的表達(dá)又被劃分成3個(gè)等級:0分（無著色），1分（淺黃色顆粒），2分（深黃色或者黃褐色顆粒）。每一張組織切片都對應(yīng)一個(gè)百分比分?jǐn)?shù)和著色分?jǐn)?shù)，將二者相乘，所得

7、的乘積即為該切片的最終得分。將小于或者等于4分的定義為陰性表達(dá)，而大于4分者定義為陽性表達(dá)。
　　3、Western Blot
　　采用RIPA裂解液對組織或細(xì)胞進(jìn)行充分裂解，然后分別提取其總蛋白，取60微克的總蛋白通過6％、8％、10％濃度的SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，然后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。5％脫脂奶粉封閉1小時(shí)，一抗WWC3(1∶500)，GAPDH(1∶10000)(Sigma，St.Louis, MO, USA)

8、, snail(1∶1000, Cell Signaling Technology Danvers, MA, USA),E-cadherin, N-cadherin(1∶1000, BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, USA),4℃過夜。山羊抗兔鼠二抗(1∶2500，Cell Signaling Technology Danvers，MA，USA)37℃孵育1小時(shí)。ECL發(fā)光后，Im

9、ageJ進(jìn)行條帶灰度值測定，以與GAPDH的比值作為相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次取均值。
　　4、集落形成實(shí)驗(yàn)
　　在A549和H1299中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3質(zhì)粒或干擾序列48h后，將細(xì)胞接種到6厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿（A549，H12991000個(gè)/皿）孵育12天。用PBS洗滌，并用吉姆薩染色。有超過50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
　　5、細(xì)胞基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)
　　在24孔板中以雙無的1640培養(yǎng)基按照1∶3的比例稀釋基質(zhì)膠(BD

10、Biosciences)，鋪8微米孔徑的上室(Costar)。然后將轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的A549、H1299、以100微升含有5×105個(gè)的細(xì)胞密度接種在上室并孵育16小時(shí)。下室放含有10％小牛血清的培養(yǎng)基。種植后培養(yǎng)48小時(shí)后，冰甲醇固定15分鐘，蘇木素染色。隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)數(shù)侵襲到小室下的細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值。
　　6、數(shù)據(jù)分析
　　采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，結(jié)果采用X2檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P＜0.05

11、為差異有意義。
　　結(jié)果:1、非小細(xì)胞肺癌中WWCs，E-cadherin，N-cadherin的表達(dá)模式
　　我們通過免疫組織化學(xué)的方法檢測了159例肺癌組織標(biāo)本和40例正常肺組織中WWCs的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在肺癌和正常肺組織中，WWC1，WWC2，WWC3均定位于細(xì)胞漿中，但是，WWC3在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)減少(89/159，56％)，其陽性率明顯低于正常肺組織(44％ vs.77.5％，p＜0.001)，而在肺癌組織中

12、WWC1、WWC2的陽性率與癌旁正常組織相比，并沒有明顯的差別(分別為WWC1:54％ vs.35％, p=0.151; WWC2:55.3％ vs.52.5％, p=0.859)。
　　2、WWC3的低表達(dá)與肺癌的不良預(yù)后相關(guān)
　　進(jìn)一步地，我們對WWC3的表達(dá)和肺癌的臨床病理因素的關(guān)系進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果提示W(wǎng)WC3的低表達(dá)與肺癌低分化(p=0.010)、高TNM分期(p=0.016)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.002)呈正

13、相關(guān)，但與年齡，性別，組織學(xué)類型無明顯關(guān)系。
　　3、非小細(xì)胞肺癌中WWC3的低表達(dá)與E-cadherin和N-cadherin相關(guān)
　　在連續(xù)病理切片對比分析WWC3與E-cadherin和N-cadherin表達(dá)的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)WWC3的低表達(dá)與E-cadherin的低表達(dá)正相關(guān)，而與N-cadherin的高表達(dá)呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)。
　　4、WWC3能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移
　　我們在低表達(dá)WWC3的H12

14、99中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3質(zhì)粒，在高表達(dá)WWC3的A549細(xì)胞中使用siRNA干擾WWC3的表達(dá)，集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:WWC3能夠抑制肺癌細(xì)胞克隆形成能力（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組vs.對照組，422 vs.189，p＜0.05）。而Transwell結(jié)果發(fā)現(xiàn)在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3，能夠抑制肺癌細(xì)胞的遷移能力（轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組vs.對照組，266 vs.86，p＜0.05）;反之，在A549中敲除WWC3與轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3的作用相反（集落:敲除組vs.對照組

15、，，188 vs.432; Transwell;敲除組vs.對照組，124 vs.256，p＜0.05）。
　　5、WWC3影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)
　　為了進(jìn)一步探究WWC3對肺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，我們雙向調(diào)控WWC3后，檢測了對侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)蛋白表達(dá)的影響，Western Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)WWC3能夠上調(diào)E-cadherin，下調(diào)N-cadherin及Snail表達(dá)水平;沉默W

16、WC3能夠下調(diào)E-cadherin，上調(diào)N-cadherin及Snail水平。
　　討論: WWCs蛋白家族中WWC1（也稱為KIBRA），能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)過程和細(xì)胞極性，在果蠅中，WWC1被示視作抑癌基因，通過調(diào)節(jié)Hippo信號通路，能控制組織生長和器官大小，有關(guān)前期文獻(xiàn)報(bào)道WWC1激活Hippo通路，認(rèn)為WWC1為抑癌因子，但關(guān)于WWC2和WWC3的在人類組織尤其是惡性腫瘤組織中的表達(dá)和亞細(xì)胞定位情況及其所發(fā)揮的生物學(xué)作

17、用和相關(guān)機(jī)制并無報(bào)道。在本文中，我們發(fā)現(xiàn)WWC1、WWC2、WWC3均表達(dá)于肺癌細(xì)胞漿，且WWC3在肺癌組織的表達(dá)低于癌旁正常肺組織，WWC1、WWC2并沒有明顯趨勢。
　　前期文獻(xiàn)報(bào)道WWC1抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減弱癌細(xì)胞增殖能力，而抑制WWC1的表達(dá)能減少細(xì)胞增殖，并增加癌組織侵襲性;然而，在另有學(xué)者的報(bào)道WWC1在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)、aPKC低表達(dá)和胃癌不良預(yù)后相關(guān)。這些結(jié)果說明了WWCs蛋白家族在人類腫瘤中的作用是復(fù)

18、雜的，許多深入的作用機(jī)制尚待被揭示。而我們在肺癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)WWC1的表達(dá)與正常肺組織相比，并沒有明顯的趨勢，這可能與蛋白的表達(dá)具有細(xì)胞或組織的特異性相關(guān)，也可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中WWC1并未發(fā)揮重要的作用，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。而結(jié)構(gòu)高度保守的WWC2、WWC3在腫瘤中尚無研究，Real-time PCR發(fā)現(xiàn)WWC3在肺組織中高表達(dá)，我們的結(jié)果也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，而WWC3在肺癌的表達(dá)低于肺組織，說明WWC3在肺癌的發(fā)生可能起到抑制的作用

19、，而WWC3的低表達(dá)的原因則需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來闡明。
　　我們利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)WWC3的表達(dá)與肺癌臨床病理因素之間的聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)WWC3的低表達(dá)與肺癌的低分化(p=0.010)，高TNM分期(p=0.016)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)(p=0.002)，這更加證明WWC3與肺癌密切相關(guān)。但是值得注意的是，我們檢測的病例仍然是小規(guī)模，小樣本的檢測（159例），需要更大規(guī)模的臨床病例去驗(yàn)證WWC3的作用。
　　上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在腫

20、瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，E-cadherin、N-cadherin為EMT關(guān)鍵分子，E-cadherin的下調(diào)，N-cadherin的上調(diào)和肺癌侵襲能力的增強(qiáng)密切相關(guān)。連續(xù)病理切片對比分析WWC3與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、 N-cadherin的表達(dá)關(guān)系，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，在肺癌中WWC3的低表達(dá)與E-cadherin的低表達(dá)，N-cadherin的高表達(dá)正相關(guān)。這證明了WWC3在肺癌中可能通過抑制EMT來抑制腫

21、瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　雙向調(diào)控WWC3，在H1299細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3表達(dá)質(zhì)粒，能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖與侵襲能力;相應(yīng)地，在A549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染W(wǎng)WC3-siRNA能夠明顯促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。功能學(xué)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示我們WWC3能夠抑制肺癌侵襲能力，同時(shí)在過表達(dá)WWC3后，E-cadherin表達(dá)增加，Snail和N-cadherin的表達(dá)降低，而干擾WWC3后，E-cadherin的表達(dá)降低，Snail和N-cadherin的

22、表達(dá)升高，提示W(wǎng)WC3可能通過上調(diào)E-cadherin下調(diào)Snail和N-cadherin促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲，但是WWC3如何影響E-cadherin表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，這一問題需要進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)來證實(shí)。
　　綜上所述，WWC3在肺癌細(xì)胞漿內(nèi)為低表達(dá)，且與非小細(xì)胞肺癌低分化、高TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且WWC3與E-cadherin、N-cadherin表達(dá)相關(guān)。
　　結(jié)論:1、WWC3在支氣管上皮細(xì)胞