鎘污染對(duì)放線菌生物活性和種群結(jié)構(gòu)的影響及鎘生物吸附研究.pdf

1、本項(xiàng)目以華家池旱地黃松田土壤為研究材料，運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，采用室內(nèi)培養(yǎng)及統(tǒng)計(jì)分析相結(jié)合的方法，全面探討了鎘脅迫對(duì)旱地土壤放線菌生態(tài)多樣性的影響，并以土傳致病菌-番茄潰瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)為供試菌株，分析篩選到的1株對(duì)Cmm具有較強(qiáng)抑制作用的放線菌HL-12(Streptomyces vinaceus)受鎘脅迫在純培養(yǎng)條件下及在無(wú)菌土壤環(huán)境中對(duì)C

2、mm的抑制效果。此外還分離到l株對(duì)鎘具有較強(qiáng)抗性的放線菌K33(Streptomyces psammoticus)，對(duì)2株放線菌在鎘污染水環(huán)境中對(duì)鎘的生物吸附動(dòng)力學(xué)及其吸附機(jī)理作了初步研究和比較，為建立有效的重金屬污染預(yù)警指標(biāo)體系、環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)及抗鎘微生物的有效利用提供有益的參考.本研究所獲主要結(jié)論如下：
　　 1.采用現(xiàn)代分子生態(tài)學(xué)手段研究了鎘脅迫對(duì)旱地土壤中放線菌生態(tài)多樣性的影響。在培養(yǎng)初期鎘對(duì)放線菌種群毒害作用較為明顯，與

3、對(duì)照相比，許多條帶消失，基因多樣性下降，到了培養(yǎng)后期，不同處理間的基因多樣性差異逐漸縮小，數(shù)量上仍存在一定差異。在含0.5～1.0 mg·kg-1鎘的培養(yǎng)初期DGGE圖譜中出現(xiàn)特異性條帶，為對(duì)照和高濃度鎘處理樣品中所沒(méi)有，經(jīng)序列測(cè)定及與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，與Rhodococcus sp. M51-3.3具有很高的相似性，以該序列代表菌株用來(lái)檢測(cè)土壤低濃度鎘污染具有一定的可行性.另有一條特異性DGGE條帶只出現(xiàn)在對(duì)照樣品

4、中，經(jīng)序列測(cè)定及與GenBank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，與Streptomyces sp.343E07具有很高的相似性，說(shuō)明該條帶代表菌株對(duì)鎘較為敏感，可以作為一種鎘污染環(huán)境中的特征性菌株。
　　 2.從浙江臺(tái)州一廢棄鉛鋅尾礦土壤和浙江大學(xué)華家池一處未遭受重金屬污染的旱地土壤中分別分離純化獲得l株可在含鎘300mg.l.I的LB培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)的抗鎘放線菌株和對(duì)Cmm具有較強(qiáng)抑制作用的放線菌.通過(guò)對(duì)2菌株進(jìn)行形態(tài)觀察、培養(yǎng)特征、

5、生理生化特性分析、細(xì)胞壁化學(xué)組分分析及16S rRNA基因序列同源性比較，利用DNAStar軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育地位分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，鑒定其分別屬于Streptomyces psammoticus和Streptomycesvinaceus.重金屬抗性實(shí)驗(yàn)表明，菌株K33對(duì)鉛和鋅具有良好的抗性，對(duì)銅的耐受性較差。利用圓紙片法測(cè)定菌株HL-12的發(fā)酵粗提液對(duì)Cmm的抑制作用，直徑可達(dá)11mm，利用瓊脂塊平板法測(cè)定活菌活性，直徑大小為13 m

6、m.此外，菌株HL-12對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制性較弱，對(duì)稻瘟病菌(真菌)無(wú)拮抗作用。
　　 3.研究了純培養(yǎng)及滅菌土壤環(huán)境中，鎘對(duì)菌株HL-12抑菌活性的影響。結(jié)果顯示適宜濃度鎘脅迫下，促進(jìn)放線菌的次生代謝過(guò)程，增強(qiáng)其抑菌活性，當(dāng)鎘濃度超過(guò)菌體自身調(diào)節(jié)作用，則對(duì)菌體產(chǎn)生一定的毒害作用，影響其次生代謝過(guò)程，進(jìn)而對(duì)其抑菌活性產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng).添加Ca2+，在一定程度上可以緩解鎘對(duì)菌株的毒害作用.添加低濃度C

7、a2+有利于菌株抑制Cmm生長(zhǎng)，高濃度Ca2+降低菌株HL-12對(duì)Cmm的抑制作用。在滅菌土壤中，超過(guò)土壤鎘污染臨界點(diǎn)的濃度(1.0 mg·kg-1)，菌株HL-12對(duì)Cmm仍具有一定的抑制效果，只有在鎘離子濃度超過(guò)污染臨界值3—5倍左右時(shí)，才會(huì)對(duì)菌株HL-12的抑菌活性產(chǎn)生一定的影響。
　　 4.研究了2分離菌株HL-12和K33對(duì)鎘離子的吸附動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明菌株K33在鎘污染水環(huán)境中的吸附能力較菌株HL-12要強(qiáng)。在pH為6

8、.0，菌體濃度為2.0～2.5g·1-1的條件下，一定濃度鎘溶液中處理60 min，菌株K33的最大吸附量為1.98 mol·g-1，菌株HL-12的最大吸附量為1.14 mol·g-1.Langmuir，F(xiàn)reundlich和Dubinin-Radushkevich(D-R)3個(gè)等溫吸附模型對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均可以進(jìn)行較好的模擬，Langmuir與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合效果最好.二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型能較好地模擬整個(gè)吸附過(guò)程.在pH值為2.0時(shí)，菌株K33的解

9、吸率達(dá)70％左右，可以作為生物吸附劑處理低濃度鎘污染水體。
　　 5.初步研究了放線菌對(duì)鎘的生物吸附及耐受性機(jī)理。細(xì)胞中DNA、蛋白質(zhì)、多糖、脂類4類主要組分對(duì)鎘離子的吸附具有較大差異。菌株K33和HL-12細(xì)胞中均以蛋白質(zhì)結(jié)合態(tài)鎘為主要存在形式，脂類和多糖結(jié)合態(tài)鎘的存在比例相當(dāng)，以DNA結(jié)合態(tài)鎘存在形式最少。透射電鏡觀察結(jié)果顯示，鎘對(duì)菌株HL-12形態(tài)影響較大，添加鎘后菌株HL-12體積變小，胞囊壁呈現(xiàn)變形蟲(chóng)狀，胞內(nèi)透明，胞囊