抗真菌放線菌的分離和鑒定及抗稻瘟病病菌生物活性的研究.pdf

1、由病原菌引起的植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的一類病害。本次研究從湖北省神農(nóng)架周邊地區(qū)，以不同海拔、不同土壤類型、不同生態(tài)環(huán)境以及周邊典型代表植物為采集土樣的標(biāo)準(zhǔn)，用傳統(tǒng)的平板稀釋法，在高氏1號(hào)培養(yǎng)基中加入K2Cr2O7作為雜菌抑制劑，分離所采集的土樣中的放線菌。共分離得到800株放線菌。分別以植物病原真菌為指示菌，采用菌塊法對322株放線菌進(jìn)行篩選，確定有221株菌株具有至少抗一種真菌的生物活性。其中167株放線菌有抗稻瘟病病

2、菌的生物活性，119株放線菌有抗棉黃萎病菌的生物活性，151株放線菌有抗立枯絲核菌的生物活性，125株放線菌有抗禾谷鐮刀菌的生物活性，130株放線菌有抗葡萄灰霉病菌的生物活性。
　　 本試驗(yàn)分離出來的具有抗真菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣的放線菌中有兩株菌株ⅡB21、ⅡR21具有抗很強(qiáng)的抗稻瘟病病菌的生物學(xué)活性，根據(jù)菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)學(xué)特征觀察、16S rDNA序列及其系統(tǒng)發(fā)育樹分析，初步確定菌株ⅡB21和菌株ⅡR21均為鏈霉菌屬。搖瓶發(fā)

3、酵結(jié)果表明，菌株ⅡB21和菌株ⅡR21的發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抑制稻瘟病病菌生長的生物活性。為了提高抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，對其發(fā)酵培養(yǎng)基以及發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，菌絲體培養(yǎng)基為最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180rpm搖床培養(yǎng)為較佳發(fā)酵條件。
　　 采用杯碟法分別測定24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h、192h發(fā)酵液的抗稻瘟病病菌的生物活性，抑菌圈直徑的數(shù)據(jù)表明，菌株ⅡB21、ⅡR21發(fā)酵液的次級(jí)代謝活性物質(zhì)隨發(fā)酵時(shí)

4、間的延長而逐漸增加，并于120h時(shí)菌株ⅡB21、ⅡR21抑菌活性達(dá)最大值，抑菌圈直徑分別為33.07mm、63.27mm，隨后抑菌直徑隨抑菌時(shí)間的延長而減小，因此這兩株菌株的最佳發(fā)酵時(shí)間以120h為宜。
　　 對菌株ⅡB21、ⅡR21活性物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行測定，分別取適量的發(fā)酵液濾液在4℃、室溫、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃水浴鍋中溫度處理2h以及在立式高壓滅菌鍋內(nèi)121℃的條件下分別處理20

5、min、30min，待自然冷卻至室溫后分別用杯碟法測定其抑菌活性，結(jié)果表明30℃～70℃范圍內(nèi)處理的發(fā)酵液濾液的抗稻瘟病病菌的生物活性均沒有明顯變化，但當(dāng)溫度高于90℃時(shí)菌株ⅡB21、ⅡR21的發(fā)酵液濾液的抗稻瘟病病菌的生物活性明顯降低，甚至喪失抗菌活性。
　　 用濃度為6.0mol/L HCl和6.0mol/L NaOH分別調(diào)節(jié)菌株ⅡB21、ⅡR21的原始發(fā)酵液濾液的酸堿度，使其最終的pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0

6、、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0，4℃條件下處理過夜后，再分別將濾液的pH值依次調(diào)至原始發(fā)酵液濾液的pH值，研究表明活性物質(zhì)在pH5.0～8.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿的條件下其抗菌活性明顯減弱，甚至喪失抗菌活性。
　　 根據(jù)菌株ⅡB21、ⅡR21發(fā)酵液的活性物質(zhì)在30℃～70℃、pH5.0～8.0范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，分別將其發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取，再用無水硫酸鈉脫水過夜，再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到活性物質(zhì)的粗提物，用