準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)-納米粒子復(fù)合介質(zhì)的制備及其用于DNA測(cè)序性能的研究.pdf

1、DNA的分離和測(cè)序分析是揭開遺傳密碼的關(guān)鍵。毛細(xì)管電泳(CE)是分析帶電生物大分子(如DNA和蛋白質(zhì)等)最重要的技術(shù)之一。由于篩分介質(zhì)在DNA的分離和測(cè)序分析過程中影響DNA的遷移特性和分離度，因此對(duì)篩分介質(zhì)的研究顯得非常重要。目前，無(wú)膠篩分介質(zhì)(即非交聯(lián)的高分子溶液)廣泛應(yīng)用于毛細(xì)管電泳中，通常包括線形均聚物、共聚物、混合物等。其中，高分子量線形聚丙烯酰胺(LPA)具有篩分能力強(qiáng)、讀出長(zhǎng)度長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。但是，高分子量LPA溶液的粘度很高而

2、且沒有自涂覆能力。與之不同的是，聚N，N-二甲基丙烯酰胺(PDMA)具有極好的自涂覆能力，但篩分能力較弱。雖然已經(jīng)研制和測(cè)試了大量高分子溶液用作毛細(xì)管電泳篩分介質(zhì)，但沒有一種單一均聚物溶液能滿足所有的應(yīng)用要求。因此，尋求同時(shí)具有高篩分能力和自涂覆能力的低粘度高分子溶液仍是DNA高效分析的一個(gè)重要課題。然而，研制一種新型聚合物介質(zhì)通常需要花費(fèi)大量時(shí)間和精力。近年來(lái)的研究表明，在低粘度的高分子溶液中加入某種添加劑(如多羥基化合物、蒙脫土、金

3、納米粒子、聚合物納米粒子、細(xì)菌纖維素原纖維、碳納米管等)是一種克服毛細(xì)管填充困難及改善DNA分離性能的非常有效且簡(jiǎn)單的方法。盡管在過去的數(shù)年時(shí)間里各種用于雙鏈DNA(dsDNA)分離的添加劑已引起了廣泛的關(guān)注，但有關(guān)用于單鏈DNA(ssDNA)測(cè)序的添加劑的研究還很少。因此，本論文的目的是通過將添加劑加入到聚合物中制成復(fù)合介質(zhì)來(lái)提高ssDNA測(cè)序性能。首先制備并表征了準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)(quasi-IPN)，在此基礎(chǔ)上制備了三種用于毛細(xì)管

4、電泳DNA測(cè)序的復(fù)合介質(zhì)，并研究了它們用作DNA測(cè)序介質(zhì)的性能。 1.準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)的制備及表征。 通過反相乳液聚合法制備了粘均分子量分別為1.5、3.3和6.5 MDa的LPA，接著在LPA水溶液中引發(fā)N，N-二甲基丙烯酰胺(DMA)單體聚合生成非交聯(lián)的quasi-IPN，該介質(zhì)結(jié)合了LPA的高篩分能力和PDMA的自涂覆能力。利用烏氏粘度計(jì)和1H NMR光譜儀對(duì)LPA和quasi-IPN進(jìn)行了表征，結(jié)果證明了LPA和

5、quasi-IPN的生成。 2.準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)/金納米粒子復(fù)合介質(zhì)的制備及其用于DNA測(cè)序性能的研究 制備了粒徑約為20、40和60 nm的金納米粒子(GNPs)，將其分別加入由LPA(1.5、3.3和6.5 MDa)和PDMA所組成的quasi-IPN中生成了聚合物/金屬?gòu)?fù)合介質(zhì)(quasi-IPN/GNPs)。詳細(xì)研究了各種參數(shù)(如GNPs含量、GNPs粒徑、LPA分子量、溶液濃度和溫度)對(duì)ssDNA測(cè)序性能的影響

6、。在測(cè)序條件(如堿基讀出軟件)未完全優(yōu)化的情況下，使用quasi-IPN3/GNPs40-1作為介質(zhì)，利用ABI310遺傳分析儀在50℃和150 V/cm下得到的讀出長(zhǎng)度(98％準(zhǔn)確度)為766堿基，耗時(shí)約57 min。quasi-IPN/GNPs的分離度高于不含GNPs的quasi-IPN，接近于含較高分子量LPA但不含GNPs的quasi-IPN。所以使用含低分子量LPA的quasi-IPN/GNPs可以克服使用高分子量LPA所帶來(lái)

7、的問題(如難以制備、測(cè)序濃度下粘度高及容易降解等)，從而有助于實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化。在相同測(cè)序條件下，quasi-IPN/GNPs的測(cè)序時(shí)間要少于quasi-IPN。此外，quasi-IPN/GNPs的分離重現(xiàn)性非常好，而且壽命大于一年。結(jié)果表明，GNPs與高分子鏈之間有相互作用并且生成了物理交聯(lián)點(diǎn)，它們避免了高分子鏈彼此之間的滑移，從而可以形成相對(duì)更穩(wěn)定的孔徑(更穩(wěn)固的篩分網(wǎng)絡(luò))并增加介質(zhì)的表觀分子量及它們的篩分性能，所以這些復(fù)合介質(zhì)可以顯著

8、改善DNA的測(cè)序性能。 3.準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)/官能化的金納米粒子復(fù)合介質(zhì)的制備及其用于DNA測(cè)序性能的研究 為了解決GNPs在高鹽濃度下易附聚的問題，由“grafting-to”法制備了一種新型介質(zhì)添加劑，即PDMA官能化的GNPs(GNP-PDMA)，并將其加入到由LPA(3，3 MDa)和PDMA所組成的quasi-IPN中得到了用于毛細(xì)管電泳DNA測(cè)序的聚合物/金屬?gòu)?fù)合篩分介質(zhì)(quasi-IPN/GNP-PDMA

9、)。在測(cè)序條件(如堿基讀出軟件)未完全優(yōu)化的情況下，使用quasi-IPN/GNP-PDMA-2作為分離介質(zhì)，利用ABI310遺傳分析儀在50℃和150 V/cm下得到的讀出長(zhǎng)度(98％準(zhǔn)確度)為801堿基，耗時(shí)約64 min。由于GNP-PDMA的存在可以改善GNPs與整個(gè)測(cè)序體系的相容性、增大網(wǎng)絡(luò)的纏結(jié)程度并增加GNPs在體系中的含量，從而導(dǎo)致整個(gè)篩分網(wǎng)絡(luò)更加受限和穩(wěn)固、介質(zhì)的表觀分子量更高并且孔徑更小，因此與之前的quasi-IP

10、N/GNPs相比，quasi-IPN/GNP-PDMA可以進(jìn)一步增強(qiáng)ssDNA的測(cè)序性能。此外，與其它商用介質(zhì)的比較表明，該復(fù)合介質(zhì)是一種非常有潛力的全自動(dòng)化DNA測(cè)序(特別是微流動(dòng)體系)介質(zhì)。 4.準(zhǔn)互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)/官能化的多壁碳納米管雙網(wǎng)絡(luò)復(fù)合介質(zhì)的制備及其用于DNA測(cè)序性能的研究 通過原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法(ATRP)制備了PDMA官能化的多壁碳納米管(MWNT-PDMA)添加劑，并加入到由LPA(3.3 MDa)和

11、PDMA所組成的quasi-IPN中，得到了用于毛細(xì)管電泳DNA測(cè)序的聚合物/納米管雙網(wǎng)絡(luò)復(fù)合篩分介質(zhì)(quasi-IPN/MWNT-PDMA)。詳細(xì)研究了MWNT-PDMA含量和MWNT-PDMA上PDMA側(cè)鏈分子量對(duì)ssDNA測(cè)序性能的影響。在測(cè)序條件(如堿基讀出軟件)未完全優(yōu)化的情況下，使用quasi-IPN/MWNT-PDMA2-Ⅱ作為介質(zhì)，利用ABI310遺傳分析儀在50℃和150 V/cm下得到的讀出長(zhǎng)度(98％準(zhǔn)確度)為7

12、92堿基，耗時(shí)約62 min。CE結(jié)果表明，與quasi-IPN相比，該復(fù)合介質(zhì)可以顯著改善DNA測(cè)序性能，這是因?yàn)樵趶?fù)合篩分介質(zhì)中形成了雙網(wǎng)絡(luò)，它包括一個(gè)柔性的quasi-IPN聚合物網(wǎng)絡(luò)和一個(gè)剛性的MWNTs(具有獨(dú)特的管狀結(jié)構(gòu))網(wǎng)絡(luò)。這兩種不同類型的網(wǎng)絡(luò)可以共存于介質(zhì)溶液中并相互作用，從而避免聚合物之間彼此滑移、穩(wěn)固和制約總的篩分網(wǎng)絡(luò)、增加介質(zhì)的表觀分子量并減小介質(zhì)的孔徑。此外，MWNT-PDMA上的PDMA側(cè)鏈可以與quasi-

13、IPN中的LPA或PDMA發(fā)生纏結(jié)，從而進(jìn)一步穩(wěn)固介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)。因此，quasi-IPN/MWNT-PDMA介質(zhì)中的這種更受限、更穩(wěn)固且孔徑更小的納米結(jié)構(gòu)使得測(cè)序性能更優(yōu)良。復(fù)合介質(zhì)與其它介質(zhì)的比較結(jié)果進(jìn)一步表明，它們非常有希望用于DNA測(cè)序。 總之，在納米粒子(GNPs、GNP-PDMA或MWNT-PDMA)存在條件下，DNA的測(cè)序表現(xiàn)出分離度高、重現(xiàn)性好且測(cè)序介質(zhì)壽命長(zhǎng)等特點(diǎn)，因此易于實(shí)現(xiàn)快速、高效分離DNA的目的。這些新型復(fù)合