雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)對(duì)環(huán)境脅迫的生理適應(yīng)性研究.pdf

1、雪藻(snow algae)是生活在南、北極地區(qū)以及地球上相近的極端環(huán)境中的一類特殊的淡水單細(xì)胞綠藻。低溫、高光照和強(qiáng)輻射是其生境的主要特點(diǎn)。雪地衣藻(Chlamydomonas nivalis)是這種極端生境中的代表性生物種類。在這種極端環(huán)境下，雪地衣藻必定有一套有效的抗脅迫保護(hù)機(jī)制以維持其光合系統(tǒng)、生物膜系統(tǒng)和酶系統(tǒng)的正常生理功能。本論文在實(shí)驗(yàn)室條件下建立了多種脅迫條件，從細(xì)胞生理、生化、基因表達(dá)等多層次上，深入系統(tǒng)地研究了雪地衣藻

2、對(duì)環(huán)境脅迫條件的生理響應(yīng)規(guī)律，對(duì)揭示脅迫條件下細(xì)胞抗脅迫系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制具有十分重要的理論意義。 主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下： 1．實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)條件下雪地衣藻的生長 通過系統(tǒng)比較4種培養(yǎng)基(BBM，Bold1NV，MCM，SEM)、培養(yǎng)溫度(10℃、16℃和23℃)、光照強(qiáng)度(2000～12000 lx)等人工培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)10℃，光強(qiáng)6000 lx條件下在BBM培養(yǎng)基中雪地衣藻的比生長速率最高，為0.352·d

3、-1，細(xì)胞中類胡蘿卜素含量也較其它培養(yǎng)基高，達(dá)到1.447pg/cell，確定BBM培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10℃為培養(yǎng)溫度；強(qiáng)光更適于細(xì)胞的營養(yǎng)生長和類胡蘿卜素的積累，BBM培養(yǎng)基，10℃，光強(qiáng)12000 lx條件下培養(yǎng)，細(xì)胞比生長速率為0.372·d-1，類胡蘿卜素含量達(dá)到1.532pg/cell。 2．雪地衣藻對(duì)營養(yǎng)脅迫的響應(yīng)規(guī)律 營養(yǎng)脅迫條件(缺氮、缺磷和高濃度醋酸鈉抑制)能夠誘導(dǎo)雪地衣藻在細(xì)胞增殖、生化組成與含

4、量等方面發(fā)生規(guī)律性的響應(yīng)。培養(yǎng)基中初始氮、磷的濃度越低，藻細(xì)胞的比生長速率也越低，但能促進(jìn)細(xì)胞中類胡蘿卜素的合成。其中，氮(NaNO3)初始濃度為2.5mg/L時(shí)類胡蘿卜素的含量最高，達(dá)到2.373pg/cell；磷(NaH2PO4：Na2HPO4=1：1)初始濃度為25mg/L時(shí)類胡蘿卜素的含量最高可達(dá)1.768pg/cell。醋酸鈉作為最簡(jiǎn)單的有機(jī)碳，添加到一定濃度(0～2.0g/L)能提高細(xì)胞的比生長速率和類胡蘿卜素含量，在濃度為

5、1.5g/L時(shí)分別達(dá)到最大值0.354·d-1和2.359pg/cell。 3．雪地衣藻對(duì)氧化脅迫的響應(yīng)規(guī)律 三種活性氧分子(1O2、O2—和·OH)對(duì)雪地衣藻的生長有明顯的抑制作用，且隨著活性氧發(fā)生器分子濃度的增加而增強(qiáng)，其中·OH對(duì)細(xì)胞生長的抑制作用強(qiáng)于其它兩種活性氧。三種活性氧均可促進(jìn)雪地衣藻合成類胡蘿卜素，且合成量隨活性氧發(fā)生器分子濃度的升高而增加，其中亞甲基藍(lán)(MB，1O2發(fā)生器分子)對(duì)誘導(dǎo)合成類胡蘿卜素的促進(jìn)

6、作用最顯著，MB濃度為10μmol/l時(shí)類胡蘿卜素的含量達(dá)到了2.137pg/cell，高出對(duì)照40.59％。 4．雪地衣藻對(duì)UV—B輻射的響應(yīng)規(guī)律 (1)雪地衣藻經(jīng)強(qiáng)度為70μW/cm2的UV—B輻射(紫外光照周期為12：12)處理8天后，細(xì)胞密度降低了29.40％，葉綠素a、總類胡蘿卜素和蝦青素含量分別比對(duì)照提高了35.14％、58.17％和68.37％，總脂和總糖含量分別提高了31.97％和80.12％，而蛋白質(zhì)含

7、量下降了20.85％，氨基酸總量降低了20.13％，必需氨基酸含量降低了24.97％。脂肪酸的種類有所增加，出現(xiàn)了新的脂肪酸C20：5和C22：6，多不飽和脂肪酸的含量明顯升高，升高幅度為13.71％，但飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量下降了32.12％和11.84％。說明UV—B輻射能夠引起細(xì)胞生化成分發(fā)生較大轉(zhuǎn)變； (2)UV—B輻射明顯強(qiáng)化了雪地衣藻細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的功能。超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化

8、氫酶(CAT)的活性均出現(xiàn)不同程度的增加，且三種酶的活性在輻射處理初期(1～2d)增幅最大，最高值分別達(dá)到了初始時(shí)的6.86倍(SOD)、2.13倍(POD)和2.23倍(CAT)，之后趨于緩慢回落，顯示出對(duì)UV—B輻射的迅速響應(yīng)和生理適應(yīng)性。采用DCFH—DA熒光探針分析了細(xì)胞內(nèi)自由基的淬滅劑—蝦青素的含量，發(fā)現(xiàn)它與胞內(nèi)活性氧濃度(DCF的生成量，以熒光強(qiáng)度表示)呈負(fù)相關(guān)。在UV—B處理的細(xì)胞中，DCF生成量是對(duì)照的39.93％，而蝦

9、青素含量是對(duì)照的1.64倍，達(dá)到1.069pg/cell，充分證明了雪地衣藻可通過胞內(nèi)積累蝦青素來淬滅UV—B輻射所產(chǎn)生的活性氧，起到抗氧化保護(hù)作用。 5．UV—B輻射下雪地衣藻的基因表達(dá)差異性 采用mRNA差異顯示技術(shù)研究了UV—B輻射下雪地衣藻的基因表達(dá)差異性，發(fā)現(xiàn)UV—B輻射處理能使細(xì)胞在基因表達(dá)上產(chǎn)生了一定的差異?？俶RNA的RT—PCR產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，UV—B輻射的細(xì)胞出現(xiàn)了一些新的基因擴(kuò)增片段。