櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建及重復(fù)元件的進(jìn)化分析.pdf

1、本文論述了了櫛孔扇貝遺傳圖譜的構(gòu)建及重復(fù)元件的進(jìn)化分析，全文分為四部分： 1.櫛孔扇貝AFLP遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。應(yīng)用AFLP技術(shù)，本研究首次構(gòu)建了櫛孔扇貝的遺傳連鎖圖譜。共21對(duì)引物組合用于AFLP分析。F1子代群體的多態(tài)位點(diǎn)比率為62.94％。在檢測(cè)的783個(gè)多態(tài)性標(biāo)記中，317個(gè)標(biāo)記呈1：1分離，190個(gè)標(biāo)記呈3：1分離，其余276個(gè)標(biāo)記呈顯著偏分離。應(yīng)用軟件.MAPMSKER/EXP進(jìn)行連鎖分析，其中LOD設(shè)為2.5且θ

2、設(shè)為0.30。雄性圖譜含19個(gè)連鎖群，共94個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)1511.4 cM，覆蓋率為66.56％；雌性圖譜含20個(gè)連鎖群，共97個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)1610.2 cM，覆蓋率為66.05％。雌雄圖譜中AFLP標(biāo)記的分布相對(duì)比較均勻。 2.櫛孔扇貝rDNA家族在自然群體內(nèi)的動(dòng)態(tài)協(xié)同進(jìn)化模式。rDNA家族，作為串聯(lián)重復(fù)多基因家族的一員，各重復(fù)單元間呈協(xié)同進(jìn)化。本研究主要通過(guò)調(diào)查ITS序列的indel(insertion/deletion，即

3、插入/缺失)多態(tài)性來(lái)研究櫛孔扇貝rDNA家族在自然群體內(nèi)的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程。在優(yōu)化的條件下，由indel導(dǎo)致的異源雙鏈分子可以在DHPLC(denaturing high-performance liquid chromatography)分析中被有效鑒別。應(yīng)用該項(xiàng)技術(shù)，我們篩查了櫛孔扇貝自然群體40個(gè)個(gè)體ITS序列的indel多態(tài)性。令人驚訝的是，僅7.5％的個(gè)體的ITS的組成是純合的，而其它的個(gè)體(92.5％)為雜合的。基于DHPLC分

4、析中不同的峰型，7個(gè)個(gè)體被選擇通過(guò)測(cè)序的方法來(lái)調(diào)查個(gè)體內(nèi)的indel多態(tài)性。進(jìn)一步，單精子內(nèi)indel多態(tài)性在更多的不同峰型個(gè)體中被調(diào)查?；谶@些結(jié)果，本研究提出一個(gè)符合櫛孔扇貝rDNA家族在自然群體內(nèi)協(xié)同進(jìn)化的叛模式。不同于以往提出的模式，占群體最高比例的雙峰個(gè)體可以被看作處于穩(wěn)定和平衡的狀態(tài)。這一狀態(tài)由快速的染色體內(nèi)重組機(jī)制所維持。單峰個(gè)體可以被看作處于取得完全均質(zhì)化狀態(tài)。它們?cè)谌后w內(nèi)僅占很低比例，因而染色體間重組的速度慢于染色體內(nèi)

5、重組的速度。三峰個(gè)體可以被看作處于正均質(zhì)化一個(gè)突變體。該突變體可通過(guò)突變或染色體間重組產(chǎn)生。它們?cè)谌后w內(nèi)占相當(dāng)高的比例，這一點(diǎn)或許暗示染色體間重組的速度并不低。 3.櫛海雜交扇貝(Chlamys.farreri♀×Argopecten irradians♂)早期發(fā)育過(guò)程中rDNA家族由偏向性基因轉(zhuǎn)變介導(dǎo)的快速協(xié)同進(jìn)化。調(diào)查了櫛海雜交扇貝早期發(fā)育過(guò)程中其基因組內(nèi)親本。ITS序列的變化。獲得的主要結(jié)果為：(1)PCR-RFLP分析結(jié)

6、果顯示雜種基因組內(nèi)父本ITS的數(shù)量隨著雜種的發(fā)育而逐漸減少，甚至在受精后14天時(shí)幾乎完全消失；(2)FISH(fluorescence insitu hybridization)分析結(jié)果顯示在雜種基因組內(nèi)母本ITS序列被發(fā)現(xiàn)存在于父本來(lái)源的染色體上，而父本ITS序列卻未被發(fā)現(xiàn)存在于母本來(lái)源的染色體上：(3)應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)在雜種基因組內(nèi)鑒別出6個(gè)重組突變體。由于重組區(qū)域比較短，因而位點(diǎn)特異性重組或許參與這一偏向性的基因轉(zhuǎn)變過(guò)程。

7、基于這些結(jié)果，我們推斷rDNA家族在櫛海雜種早期發(fā)育過(guò)程中發(fā)生了由偏向性基因轉(zhuǎn)變引發(fā)的快速的協(xié)同進(jìn)化。 4.櫛孔扇貝與扇貝科其它7種扇貝ITSl二級(jí)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)進(jìn)化與結(jié)構(gòu)進(jìn)化分析。目前，在序列比對(duì)過(guò)程中對(duì)缺口進(jìn)行精確定位十分困難。當(dāng)比對(duì)的序列具高度變異性時(shí)，這一缺點(diǎn)尤為突出。為了克服這一困難，本研究提出了一個(gè)新的策略用于解決基于高變序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行系統(tǒng)推斷問(wèn)題。在這個(gè)新策略中，完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)被直接用作聚類的字符，因而不再需要將其

8、分解成同源的亞結(jié)構(gòu)。本研究的結(jié)果顯示，可靠的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系可以從完整的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)中推斷得出，但不能從序列比對(duì)中推斷得出(即便輔以結(jié)構(gòu)的信息)。因而本研究結(jié)果充分支持這一新策略的在實(shí)踐上的可行性。此外，本研究還調(diào)查了扇貝科8種扇貝ITSl二級(jí)結(jié)構(gòu)的進(jìn)化情況。完整的ITSl二級(jí)結(jié)構(gòu)可以被分為4個(gè)結(jié)構(gòu)域?；パa(bǔ)性的堿基變化被發(fā)現(xiàn)存在于這4個(gè)結(jié)構(gòu)域中。進(jìn)一步，4個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守的結(jié)構(gòu)模序被鑒別出來(lái)。這些模序，特別是：D2和D3中的模序，或許在rRN

9、A的成熟過(guò)程中起著重要的作用。5櫛孔扇貝和蝦夷扇貝Ty31Gypsy類群Mag系反轉(zhuǎn)座子CFGl和PYGl的克隆與特性分析本研究首次從櫛孔扇貝和蝦夷扇貝基因組內(nèi)克隆得到Ty3/Gypsy類群Mag系的兩個(gè)反轉(zhuǎn)座子CFG1和PYG1。CFG1元件的全長(zhǎng)為4826bp，包括5'-LTR(192bp)，完整的ORF(4047bp)和3'-LTR(189bp)。CFG1和PYG1元件完整的ORF包含1348個(gè)氨基酸，未發(fā)現(xiàn)閱讀框移位現(xiàn)象。與它們

10、關(guān)系最近的是花斑劍尾魚(yú)的Jule元件。櫛孔扇貝二倍體基因組約含84個(gè)拷貝的CFG1元件。對(duì)于CFG1，PYG1和Ty31Gypsy類群Mag系的其它元件，本研究總結(jié)了它們的主要特征，并比較了它們反轉(zhuǎn)錄酶(RT)域的3D結(jié)構(gòu)。CFG1元件在幼蟲(chóng)期mRNA的表達(dá)量的變化規(guī)律為：在原腸胚前，其逐漸升高；在原腸胚后，其逐漸降低。而CFG1元件在閉殼肌和消化腺組織中mRNA的表達(dá)量比成體的其它組織略微低一些?？偟膩?lái)看，CFG1元件mRNA的表達(dá)量