苯并[α]芘對櫛孔扇貝生殖毒性機制的研究.pdf

1、本文參照目前我國近海多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)代表物質(zhì)之一苯并[α]芘(benzo[α]pyrene，BaP)的真實污染程度，以近海養(yǎng)殖重要經(jīng)濟貝類櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)為研究對象，篩選了BaP脅迫下性腺差異表達基因，測定了櫛孔扇貝性腺及血淋巴性激素含量，探究了多濃度多時間點BaP脅迫下生殖毒性響應關(guān)鍵基因的表達模式，并研究了BaP脅迫對櫛孔扇貝卵巢、精巢DN

2、A單鏈斷裂、蛋白質(zhì)羰基含量、MDA含量影響，最后以組織顯微切片的方式驗證BaP對櫛孔扇貝性腺造成的生殖毒性。得到的具體實驗結(jié)果如下:
　　1.櫛孔扇貝在BaP脅迫下性腺差異表達基因的篩選與分析
　　本實驗運用數(shù)字基因表達譜技術(shù)（Digital gene expression，DGE）根據(jù)櫛孔扇貝性腺組織對照組和0.5μg/L BaP染毒組10d的DGE數(shù)據(jù)對比篩選差異表達基因。其中精巢組織對照組與染毒組分別獲取1248505

3、5和14454127條cleanreads，將clean reads與本實驗室已提交的櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組(SRP018044) unigene進行拼接比對，比對率分別為74.24％和77.27％;通過數(shù)據(jù)分析，共篩得差異表達基因1051條，其中上調(diào)基因223條，下調(diào)基因828條。經(jīng)GO功能聚類分析顯示，差異基因主要涉及芳香族化合物代謝、ATP代謝、免疫防御、細胞凋亡和精子發(fā)育、精子分化等功能;KEGG通路分析表明富集顯著的代謝通路包括三羧酸

4、循環(huán)通路、氧化磷酸化通路、NOD-like受體信號通路、類固醇合成通路等。運用實時熒光定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)，選取9條差異表達關(guān)鍵基因(HSP90、CYP3A、HGD、CDK2、IAP、TSSK2、PDE5和17HSD、E2SULT)驗證了DGE結(jié)果的可靠性。
　　卵巢組織對照組和染毒組DGE分別獲取13，666，882和14，276，579條clean reads，比對率分別為74.55％和78.46％，共篩得差異表達

5、基因124條，其中上調(diào)基因42條，下調(diào)基因82條。與苯并芘生殖毒性相關(guān)的差異基因主要聚類于解毒代謝、細胞外基質(zhì)與細胞間相互作用的損傷效應、內(nèi)分泌干擾效應和組織損傷等效應。由以上看出，櫛孔扇貝在BaP脅迫下精巢的解毒代謝、能量代謝和免疫防御等功能發(fā)生了變化，引起了細胞凋亡等損傷效應，并干擾了類固醇（性激素前體物質(zhì)）的合成和精子的形成過程;卵巢的解毒代謝、細胞骨架及性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達水平發(fā)生了變化，引起了細胞質(zhì)基質(zhì)疏松，造成了損傷效應，

6、并干擾卵巢發(fā)育等過程。
　　2.櫛孔扇貝在BaP脅迫下生殖內(nèi)分泌干擾效應的研究
　　本實驗將櫛孔扇貝暴露于染毒濃度為0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中，分別于0、3d、10d、21d取樣，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定櫛孔扇貝精巢卵巢及血淋巴中性激素的含量，采用實時定量PCR技術(shù)測定了DGE測序篩得的差異表達的細胞粘連、凋亡相關(guān)基因（♀-ITGA9、COL6A3，♂-5IAP、CDK2），性激素合成和性腺發(fā)育相關(guān)基因(♀-

7、CYP17、3β-HSD、17β-HSD、ER、VTG，♂-CYP17、3β-HSD、17β-HSD、TSSK2、PDE)，研究了BaP脅迫對櫛孔扇貝性激素含量的影響，探究了多濃度多時間點BaP脅迫下生殖毒性響應關(guān)鍵基因的表達模式。本研究中BaP脅迫對櫛孔扇貝性腺組織和血淋巴三種激素含量均產(chǎn)生了顯著影響。在卵巢組織中，BaP顯著降低了三種激素含量，且呈時間劑量效應;雌性扇貝血淋巴中，0-3d時，BaP對雌二醇和睪酮含量有誘導升高趨勢，隨

8、后明顯下降，后恢復至或低于對照水平，孕酮含量始終低于對照組水平;在精巢組織中，BaP顯著抑制了雌二醇含量，但對睪酮卻有誘導其升高作用，顯示出一定的雄激素效應，孕酮含量被低濃度BaP誘導升高，被高濃度BaP抑制;而在雄性扇貝血淋巴中，BaP對三種激素含量都有誘導升高趨勢，隨后各染毒組三種激素含量降低，并顯著低于對照組水平。由實驗結(jié)果可知，在實驗期間血淋巴中的性激素水平的變化和性腺中的變化并不完全一致，且精巢和卵巢組織三種激素受BaP的影響

9、也不盡相同。BaP也顯著影響了櫛孔扇貝性腺解毒代謝損傷響應基因、性激素合成相關(guān)基因及性腺發(fā)育基因的表達水平，染毒濃度不同造成的影響程度不同，對雌、雄性腺同一基因也呈現(xiàn)出不盡相同的誘導模式，表現(xiàn)出了毒性效應和內(nèi)分泌干擾效應。
　　3.櫛孔扇貝在BaP脅迫下性腺損傷效應的研究
　　本研究將櫛孔扇貝暴露于染毒濃度為0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中，分別于0、1d、3d、6d、10d、15d、21d取樣，測定堿解旋F值、

10、脂質(zhì)LPO水平和蛋白質(zhì)羰基含量鑒定BaP對三大物質(zhì)造成的影響。研究表明BaP脅迫對櫛孔扇貝卵巢、精巢DNA單鏈斷裂、蛋白質(zhì)羰基含量、MDA含量影響顯著。櫛孔扇貝性腺組織各染毒組F值在實驗期間呈下降趨勢，且0.5、2.5μg/L BaP染毒對櫛孔扇貝性腺DNA損傷（F值表示）影響顯著(P＜0.05)，呈時間劑量效應。卵巢、精巢各處理組蛋白質(zhì)羰基含量先升高后降低后反彈并于實驗結(jié)束時顯著高于對照組水平。染毒期間，性腺組織各組MDA含量有逐漸升

11、高趨勢，且2.5μg/L BaP染毒組15d時MDA含量均顯著高于對照組水平。實驗表明，不同濃度的BaP均對櫛孔扇貝性腺造成了顯著的DNA斷裂損傷、脂質(zhì)LPO與蛋白質(zhì)羰基化程度的升高。蛋白質(zhì)羰基含量在染毒期間呈現(xiàn)了明顯的應急期和修復期，但最終還是造成了損傷。MDA含量呈波動變化，也表現(xiàn)出了櫛孔扇貝對BaP的解毒代謝響應，最終也還是含量顯著升高。表明了BaP能通過氧化損傷途徑對櫛孔扇貝性腺產(chǎn)生毒性作用，隨著染毒時間延長均能夠得到不同程度的

12、修復，但這種修復在不同濃度BaP處理組之間也存在差異。
　　4.BaP對櫛孔扇貝精巢、卵巢顯微結(jié)構(gòu)的影響
　　本研究將櫛孔扇貝暴露于染毒濃度為0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中，于15和21d時取精巢、卵巢制成組織切片，觀察BaP對櫛孔扇貝性腺組織的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對照組，隨BaP染毒濃度增加，櫛孔扇貝卵巢濾泡間出現(xiàn)空隙并呈增大趨勢，同時卵母細胞間排列也較疏松，卵母細胞變形且細胞質(zhì)中也出現(xiàn)空隙，且到21d時，卵

13、母細胞變形嚴重且出現(xiàn)了退化現(xiàn)象，濾泡壁細胞受損，排列散亂，界限變模糊;櫛孔扇貝精巢隨著各處理組染毒濃度增加，精巢濾泡內(nèi)出現(xiàn)空隙并呈增大趨勢，精子數(shù)量減少，隨時間延長，精子間縫隙變大，精子排列無規(guī)則，不再呈緊密的輻射狀。研究表明BaP能顯著影響櫛孔扇貝性腺的發(fā)育，使得性腺組織濾泡內(nèi)生殖細胞數(shù)量增殖延緩，且能毒害生殖細胞使其變形，排列無序。此外BaP還損傷了性腺組織中濾泡壁的結(jié)構(gòu)，使濾泡壁細胞間質(zhì)疏松，濾泡壁界限模糊。由此可以看出BaP具有