苯并[α]芘對櫛孔扇貝生殖毒性機(jī)制的研究.pdf

1、本文參照目前我國近海多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)代表物質(zhì)之一苯并[α]芘(benzo[α]pyrene，BaP)的真實(shí)污染程度，以近海養(yǎng)殖重要經(jīng)濟(jì)貝類櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)為研究對象，篩選了BaP脅迫下性腺差異表達(dá)基因，測定了櫛孔扇貝性腺及血淋巴性激素含量，探究了多濃度多時(shí)間點(diǎn)BaP脅迫下生殖毒性響應(yīng)關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，并研究了BaP脅迫對櫛孔扇貝卵巢、精巢DN

2、A單鏈斷裂、蛋白質(zhì)羰基含量、MDA含量影響，最后以組織顯微切片的方式驗(yàn)證BaP對櫛孔扇貝性腺造成的生殖毒性。得到的具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.櫛孔扇貝在BaP脅迫下性腺差異表達(dá)基因的篩選與分析
　　本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)（Digital gene expression，DGE）根據(jù)櫛孔扇貝性腺組織對照組和0.5μg/L BaP染毒組10d的DGE數(shù)據(jù)對比篩選差異表達(dá)基因。其中精巢組織對照組與染毒組分別獲取1248505

3、5和14454127條cleanreads，將clean reads與本實(shí)驗(yàn)室已提交的櫛孔扇貝轉(zhuǎn)錄組(SRP018044) unigene進(jìn)行拼接比對，比對率分別為74.24％和77.27％;通過數(shù)據(jù)分析，共篩得差異表達(dá)基因1051條，其中上調(diào)基因223條，下調(diào)基因828條。經(jīng)GO功能聚類分析顯示，差異基因主要涉及芳香族化合物代謝、ATP代謝、免疫防御、細(xì)胞凋亡和精子發(fā)育、精子分化等功能;KEGG通路分析表明富集顯著的代謝通路包括三羧酸

4、循環(huán)通路、氧化磷酸化通路、NOD-like受體信號通路、類固醇合成通路等。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)技術(shù)，選取9條差異表達(dá)關(guān)鍵基因(HSP90、CYP3A、HGD、CDK2、IAP、TSSK2、PDE5和17HSD、E2SULT)驗(yàn)證了DGE結(jié)果的可靠性。
　　卵巢組織對照組和染毒組DGE分別獲取13，666，882和14，276，579條clean reads，比對率分別為74.55％和78.46％，共篩得差異表達(dá)

5、基因124條，其中上調(diào)基因42條，下調(diào)基因82條。與苯并芘生殖毒性相關(guān)的差異基因主要聚類于解毒代謝、細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞間相互作用的損傷效應(yīng)、內(nèi)分泌干擾效應(yīng)和組織損傷等效應(yīng)。由以上看出，櫛孔扇貝在BaP脅迫下精巢的解毒代謝、能量代謝和免疫防御等功能發(fā)生了變化，引起了細(xì)胞凋亡等損傷效應(yīng)，并干擾了類固醇（性激素前體物質(zhì)）的合成和精子的形成過程;卵巢的解毒代謝、細(xì)胞骨架及性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化，引起了細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)疏松，造成了損傷效應(yīng)，

6、并干擾卵巢發(fā)育等過程。
　　2.櫛孔扇貝在BaP脅迫下生殖內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的研究
　　本實(shí)驗(yàn)將櫛孔扇貝暴露于染毒濃度為0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中，分別于0、3d、10d、21d取樣，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測定櫛孔扇貝精巢卵巢及血淋巴中性激素的含量，采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)測定了DGE測序篩得的差異表達(dá)的細(xì)胞粘連、凋亡相關(guān)基因（♀-ITGA9、COL6A3，♂-5IAP、CDK2），性激素合成和性腺發(fā)育相關(guān)基因(♀-

7、CYP17、3β-HSD、17β-HSD、ER、VTG，♂-CYP17、3β-HSD、17β-HSD、TSSK2、PDE)，研究了BaP脅迫對櫛孔扇貝性激素含量的影響，探究了多濃度多時(shí)間點(diǎn)BaP脅迫下生殖毒性響應(yīng)關(guān)鍵基因的表達(dá)模式。本研究中BaP脅迫對櫛孔扇貝性腺組織和血淋巴三種激素含量均產(chǎn)生了顯著影響。在卵巢組織中，BaP顯著降低了三種激素含量，且呈時(shí)間劑量效應(yīng);雌性扇貝血淋巴中，0-3d時(shí)，BaP對雌二醇和睪酮含量有誘導(dǎo)升高趨勢，隨

8、后明顯下降，后恢復(fù)至或低于對照水平，孕酮含量始終低于對照組水平;在精巢組織中，BaP顯著抑制了雌二醇含量，但對睪酮卻有誘導(dǎo)其升高作用，顯示出一定的雄激素效應(yīng)，孕酮含量被低濃度BaP誘導(dǎo)升高，被高濃度BaP抑制;而在雄性扇貝血淋巴中，BaP對三種激素含量都有誘導(dǎo)升高趨勢，隨后各染毒組三種激素含量降低，并顯著低于對照組水平。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)驗(yàn)期間血淋巴中的性激素水平的變化和性腺中的變化并不完全一致，且精巢和卵巢組織三種激素受BaP的影響

9、也不盡相同。BaP也顯著影響了櫛孔扇貝性腺解毒代謝損傷響應(yīng)基因、性激素合成相關(guān)基因及性腺發(fā)育基因的表達(dá)水平，染毒濃度不同造成的影響程度不同，對雌、雄性腺同一基因也呈現(xiàn)出不盡相同的誘導(dǎo)模式，表現(xiàn)出了毒性效應(yīng)和內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。
　　3.櫛孔扇貝在BaP脅迫下性腺損傷效應(yīng)的研究
　　本研究將櫛孔扇貝暴露于染毒濃度為0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中，分別于0、1d、3d、6d、10d、15d、21d取樣，測定堿解旋F值、

10、脂質(zhì)LPO水平和蛋白質(zhì)羰基含量鑒定BaP對三大物質(zhì)造成的影響。研究表明BaP脅迫對櫛孔扇貝卵巢、精巢DNA單鏈斷裂、蛋白質(zhì)羰基含量、MDA含量影響顯著。櫛孔扇貝性腺組織各染毒組F值在實(shí)驗(yàn)期間呈下降趨勢，且0.5、2.5μg/L BaP染毒對櫛孔扇貝性腺DNA損傷（F值表示）影響顯著(P＜0.05)，呈時(shí)間劑量效應(yīng)。卵巢、精巢各處理組蛋白質(zhì)羰基含量先升高后降低后反彈并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)顯著高于對照組水平。染毒期間，性腺組織各組MDA含量有逐漸升

11、高趨勢，且2.5μg/L BaP染毒組15d時(shí)MDA含量均顯著高于對照組水平。實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的BaP均對櫛孔扇貝性腺造成了顯著的DNA斷裂損傷、脂質(zhì)LPO與蛋白質(zhì)羰基化程度的升高。蛋白質(zhì)羰基含量在染毒期間呈現(xiàn)了明顯的應(yīng)急期和修復(fù)期，但最終還是造成了損傷。MDA含量呈波動變化，也表現(xiàn)出了櫛孔扇貝對BaP的解毒代謝響應(yīng)，最終也還是含量顯著升高。表明了BaP能通過氧化損傷途徑對櫛孔扇貝性腺產(chǎn)生毒性作用，隨著染毒時(shí)間延長均能夠得到不同程度的

12、修復(fù)，但這種修復(fù)在不同濃度BaP處理組之間也存在差異。
　　4.BaP對櫛孔扇貝精巢、卵巢顯微結(jié)構(gòu)的影響
　　本研究將櫛孔扇貝暴露于染毒濃度為0、0.1、0.5、2.5μg/L的BaP中，于15和21d時(shí)取精巢、卵巢制成組織切片，觀察BaP對櫛孔扇貝性腺組織的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比對照組，隨BaP染毒濃度增加，櫛孔扇貝卵巢濾泡間出現(xiàn)空隙并呈增大趨勢，同時(shí)卵母細(xì)胞間排列也較疏松，卵母細(xì)胞變形且細(xì)胞質(zhì)中也出現(xiàn)空隙，且到21d時(shí)，卵

13、母細(xì)胞變形嚴(yán)重且出現(xiàn)了退化現(xiàn)象，濾泡壁細(xì)胞受損，排列散亂，界限變模糊;櫛孔扇貝精巢隨著各處理組染毒濃度增加，精巢濾泡內(nèi)出現(xiàn)空隙并呈增大趨勢，精子數(shù)量減少，隨時(shí)間延長，精子間縫隙變大，精子排列無規(guī)則，不再呈緊密的輻射狀。研究表明BaP能顯著影響櫛孔扇貝性腺的發(fā)育，使得性腺組織濾泡內(nèi)生殖細(xì)胞數(shù)量增殖延緩，且能毒害生殖細(xì)胞使其變形，排列無序。此外BaP還損傷了性腺組織中濾泡壁的結(jié)構(gòu)，使濾泡壁細(xì)胞間質(zhì)疏松，濾泡壁界限模糊。由此可以看出BaP具有