CD95信號促進有機污染物暴露的肝細胞損傷及其機制.pdf

1、目的：觀察飲用水有機污染物對人正常肝細胞系L02細胞株的細胞毒性，并從細胞增殖、炎性因子及其調(diào)控的角度，探討 CD95信號介導(dǎo)核因子-κB(nuclear factorκB，NF-κB）分子途徑活化在肝細胞損傷中的作用，為飲用水有機污染物致肝細胞毒性機制的完善及闡明提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:利用固相萃取法提取飲用水中有機污染物。體外培養(yǎng) L02細胞，將其分別暴露于培養(yǎng)液（空白對照組）、0.1％二甲基亞砜( dimethyl sul

2、foxide,DMSO)（溶劑對照組）和0.3125、0.6250、1.2500、2.5000、5.0000 L/ml飲用水有機提取物（染毒組）中24h、48h、72h。倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)，采用MTT法觀察L02細胞的增殖情況，使用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定細胞培養(yǎng)液上清中白細胞介素6（interleukin，IL-6）、白細胞介素8（interleukin，IL-8）、白細胞介素10（interleukin，IL-10）和腫

3、瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的蛋白含量；細胞上清液中谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)的活力采用全自動生化分析儀進行檢測；應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction， RT

4、-qPCR)法檢測IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、CD95和CD95L基因 mRNA表達水平；免疫印跡（Western blot）方法觀察CD95、CD95L蛋白表達水平和NF-κB信號通路的激活情況。
　　結(jié)果：（1）飲用水有機提取物對L02細胞形態(tài)學(xué)的影響：隨著有機提取物濃度的增加及時間的延長，細胞縮小變圓，間隙變大，貼壁細胞明顯減少，懸浮的死亡細胞逐漸增加。（2）對L02細胞增殖的影響：隨染毒劑量的增加，細胞增殖

5、水平逐漸降低，各染毒組的細胞增殖均明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。且隨染毒時間的延長，細胞增殖水平呈降低趨勢，與24h比較，48及72h增殖水平的降低具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。（3）對CD95及其配體表達水平的影響：CD95基因mRNA表達水平在24h的5.0000L/ml組、48h的1.2500L/ml組和72h的0.6250L/ml組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其蛋白表達水平亦呈升高趨勢，在48h的1.25

6、00L/ml組以及72h的0.3125L/ml組明顯升高(P<0.05)。而CD95L基因mRNA表達水平在48h的2.5000L/ml組和72h的1.2500L/ml組明顯升高(P<0.05)，其蛋白表達水平在24h的5.0000L/ml組、48h的2.5000L/ml組和72h的0.6250L/ml組升高明顯(P<0.05)。（4）對NF-kB信號通路相關(guān)基因的影響：隨著有機提取物染毒濃度的增加，IκB蛋白表達水平逐漸降低，在24h

7、、48h和72h時點，次低劑量組（0.6250L/ml）蛋白表達水平均明顯低于溶劑對照組(P<0.05)。p65蛋白表達水平則逐漸升高，在24 h和48 h時點，較低劑量組（1.2500 L/ml）蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；而在72 h時點，次低劑量組（0.6250L/ml）即升高明顯(P<0.05)。（5）飲用水有機提取物致炎性因子表達的改變：IL-6基因mRNA表達水平在染毒24h的1.2500L/ml組，48h和72h

8、的0.6250L/ml組均明顯升高(P<0.05)；其蛋白水平在各染毒組均呈升高明顯(P<0.05)。IL-8基因 mRNA表達水平在24h的2.5000L/ml組、48h的1.2500L/ml組和72h的0.6250L/ml組均明顯升高(P<0.05)；各染毒組的IL-8蛋白水平均呈升高趨勢，除24h和48h的0.3125L/ml組外，其余組的升高有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IL-10基因mRNA表達水平逐漸升高，除24h的0.31

9、25L/ml和0.6250L/ml組外，其余組的升高均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；各染毒組 IL-10蛋白水平均明顯高于溶劑對照組(P<0.05)。TNF-α基因 mRNA表達水平在染毒24h的1.2500L/ml組、48h的0.6250L/ml組和72h的0.3125L/ml組明顯升高(P<0.05)；其蛋白水平在24h的1.2500L/ml組、48h和72h的0.6250L/ml組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。（6）

10、對L02細胞相關(guān)損傷指標的影響：有機提取物處理 L02細胞后，在24h時點，AST及ALT水平在1.2500L/ml以上處理組明顯升高(P<0.05)；而在48h和72h時點，所有處理組的AST及ALT水平均明顯高于對照組(P<0.05)。（7）相關(guān)性分析：IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平與IκB蛋白表達水平均呈負相關(guān)關(guān)系（r=-0.9450、-0.8510、-0.8640、-0.8180，P<0.05）；而與p65蛋白表

11、達水平均呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.9220、0.8160、0.8280、0.8650，P<0.05）。ALT水平與IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α蛋白表達水平均呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.8420、0.7500、0.8680、0.8320，P<0.05）；而AST水平與上述指標亦呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.8490、0.7950、0.9320、0.8760，P<0.05）。
　　結(jié)論：（1）飲用水有機污染物可誘導(dǎo)L02細胞形態(tài)改變、抑制