一株假單胞菌尼古丁降解相關(guān)酶的初步研究.pdf

1、煙草中的主要生物堿尼古丁，是一種精神藥品，由于人類長期的吸食習慣，導致了對煙草中尼古丁的依賴，同時吸煙和煙氣環(huán)境嚴重威脅人類的健康；煙草加工過程產(chǎn)生了含高濃度的尼古丁的廢物，這些都屬于有毒的污染物，因此有效地控制卷煙和環(huán)境中的尼古丁的含量，對于維護人類健康有著深遠的意義。由于某些微生物具有降低煙草中尼古丁含量的作用，有關(guān)微生物代謝尼古丁的研究逐漸引起了微生物學者和煙草研究人員的關(guān)注。但有關(guān)這方面的研究主要集中在細菌的兩個屬：假單胞菌屬和

2、節(jié)桿菌屬。其中，對氧化節(jié)桿菌(Arthrobactel oxidans)作了較系統(tǒng)的研究，闡明了它的代謝途徑，涉及到的酶及基因序列己基本清楚；但對于假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)細菌，只初步分析了代謝途徑，相關(guān)的酶學證據(jù)、酶和基因方面的研究還沒有進行。本實驗室經(jīng)過前期的工作獲得一株可以降解尼古丁的假單胞菌株S16，并純化了代謝途徑中的兩種中間產(chǎn)物3-琥珀酰吡啶 (3-Succinoyl pyridine,SP)和6-羥基

3、-3-琥珀酰吡啶(6-Hvdroxy-3-succinoylpyridine，HSP)。本論文的工作中，以該假單胞菌株和上述的2種中間產(chǎn)物為研究對象，對粗酶液作用下的這兩種化合物的反應開展初步研究。 以假單胞菌S16的粗酶液為催化劑，SP和HSP依次為底物，檢測生成的產(chǎn)物，進一步確定反應時底物SP和產(chǎn)物HSP，底物HSP和產(chǎn)物2,5-二羥基吡啶(2,5-DihydroxypyTidine,DHP)之間量的關(guān)系，結(jié)果證明SP在S1

4、6粗酶液作用下生成HSP，而HSP繼續(xù)反應生成DHP和琥珀酸，進一步從酶學角度驗證了代謝途徑中的這兩步反應。 為獲得更多的細胞催化劑，優(yōu)化S16的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選擇不同的碳氮源，并通過綜合考慮休止細胞對尼古丁的降解活性和獲得的細胞量來確定外加碳氮源的種類和比例，經(jīng)過優(yōu)化確定以葡萄糖為碳源，濃度1％，硫酸銨為氮源，濃度0.4％，尼古丁濃度為lmg/ml，在生長12h后其OD<,620nm>?？蛇_到7.0左右，細胞的活性與未添加葡萄糖

5、和硫酸銨的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的細胞基本一致。在該優(yōu)化條件下，設(shè)計實驗驗證SP、HsP和DHP對假單胞菌S16的酶系的誘導作用，結(jié)果沒有加入誘導物的粗酶液對這幾種化合物都沒有活性，加入誘導物后粗酶液出現(xiàn)了對這三種中間物的降解能力，但不能降解尼古丁。 由于尼古丁、SP、HSP和DHP在結(jié)構(gòu)上的相似性，不能直接通過分光光度計法測定。首先建立了的各自的檢測方法，在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化各反應條件，如pH、溫度、反應所需的輔因子等，在對各酶進行了初步