CDNF對蛋白酶體的調(diào)控及其在多巴胺能神經(jīng)元變性中的作用.pdf

1、帕金森病(PD)是一種中老年常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，其病理學(xué)特征表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)致密部(SNc)多巴胺（DA）能神經(jīng)元選擇性、進(jìn)行性喪失和殘存DA能神經(jīng)元內(nèi)Lewy小體（主要成分為alpha-synuclein)的形成。盡管如此，其具體發(fā)病機制仍不太清楚。近年來多項研究表明，保守型多巴胺能神經(jīng)元營養(yǎng)因子(CDNF)CDNF不僅能顯著改善6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠行為，還能對其中腦黑質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)元變性具有顯著的保護(hù)和逆轉(zhuǎn)復(fù)

2、蘇作用。
　　因此，本研究目的首先在于明確CDNF對蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的PD模型是否具有神經(jīng)保護(hù)和逆轉(zhuǎn)作用，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索其對蛋白酶體表達(dá)水平、水解酶活性的調(diào)控作用。以此來論證這種“CDNF—蛋白酶體—保護(hù)和逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元”新型神經(jīng)保護(hù)機制的設(shè)想，闡明蛋白酶體系統(tǒng)功能活性在“CDNF保護(hù)和逆轉(zhuǎn)DA能神經(jīng)元變性機制”中的作用，為CDNF對DA能神經(jīng)元變性保護(hù)和逆轉(zhuǎn)作用機制的研究開辟新靶點。
　　方法:研究一、CDNF對蛋

3、白酶體抑制誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元變性的作用
　　首先，構(gòu)建CDNF基因重組桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid-CDNF，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，采取Bac-to-Bac蛋白表達(dá)系統(tǒng)，按照分子克隆方法完成CDNF蛋白的大量表達(dá)、鑒定和純化，以備后續(xù)實驗所用。選取PC12細(xì)胞株作為誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型細(xì)胞株。將實驗設(shè)計為五組分別是:實驗組（Lactacystin/MG132）、CDNF+Lactacystin組、CDNF+MG132組、Lactacy

4、stin+CDNF組和MG132+CDNF組。先將PC12細(xì)胞種植在96孔板上(細(xì)胞密度達(dá)到2×105/ml)孵育24h。為了探討索CDNF對PC12細(xì)胞株的神經(jīng)保護(hù)作用，在細(xì)胞進(jìn)行Lactacystin/MG132誘導(dǎo)前施加200nM的CDNF作用6h，然后再分別加入12.5μM Lactacystin或5μM MG132誘導(dǎo)24h。為了探討CDNF對PC12細(xì)胞的神經(jīng)逆轉(zhuǎn)作用，先分別對其加入12.5μM Lactacystin或5μ

5、M MG132進(jìn)行誘導(dǎo)24h，然后再分別加入相同劑量(200nM)CDNF進(jìn)行共孵育24h。最后通過MTT法檢測PC12細(xì)胞活性、TH免疫熒光檢測細(xì)胞形態(tài)以及免疫熒光技術(shù)檢測alpha-synuclein蛋白的表達(dá)量。
　　研究二、CDNF對蛋白酶體表達(dá)以及水解酶活性的調(diào)控作用
　　首先，構(gòu)建CDNF基因重組桿狀病毒表達(dá)載體Bacmid-CDNF，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，采取Bac-to-Bac蛋白表達(dá)系統(tǒng)，按照分子克隆方法

6、完成CDNF蛋白的大量表達(dá)、鑒定和純化，以備后續(xù)實驗所用。選取PC12細(xì)胞株作為誘導(dǎo)PD細(xì)胞模型細(xì)胞株。將實驗設(shè)計為五組分別是:實驗組（Lactacystin/MG132）、CDNF+Lactacystin組、CDNF+MG132組、Lactacystin+CDNF組和MG132+CDNF組。先將PC12細(xì)胞種植在96孔板上（細(xì)胞密度達(dá)到2×105/ml）孵育24h。為了探討CDNF對蛋白酶體的保護(hù)作用，在細(xì)胞進(jìn)行Lactacystin

7、/MG132誘導(dǎo)前施加200nM的CDNF作用6h，然后再分別加入12.5μM Lactacystin或5μM MG132誘導(dǎo)24h。為了探討CDNF對蛋白酶體的逆轉(zhuǎn)作用，先分別對其加入12.5μM Lactacystin或5μM MG132進(jìn)行誘導(dǎo)24h，然后再分別加入相同劑量(200nM)CDNF進(jìn)行共孵育24h。最后通過ELISA法檢測26s蛋白酶體的表達(dá)以及谷氨酰肽水解酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶的含量。統(tǒng)計學(xué)分析CDNF對Lacta

8、cystin/MG132誘導(dǎo)前后的蛋白酶體和三種水解酶的表達(dá)情況，以及Lactacystin與MG132兩種蛋白酶體抑制劑之間對蛋白酶體和三種水解酶作用的差異。
　　結(jié)果:研究一、CDNF對蛋白酶體抑制誘導(dǎo)DA能神經(jīng)元變性的作用
　　就其細(xì)胞活性而言，通過MTT法檢測，PC12細(xì)胞經(jīng)12.5μM Lactacystin或5μM MG132誘導(dǎo)24h后，其細(xì)胞活性分別降低79.1％和78.6％，兩者之間的活性下降情況無統(tǒng)計學(xué)意

9、義(p＞0.05)。就其形態(tài)學(xué)而言，通過免疫熒光檢測顯示，細(xì)胞未經(jīng)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)前細(xì)胞數(shù)量多、分別均勻、核大而圓、核漿界限清晰、胞漿濃縮，誘導(dǎo)后細(xì)胞數(shù)量減少、胞體皺縮變小、結(jié)構(gòu)不清。為了探討索CDNF對PC12細(xì)胞株的神經(jīng)保護(hù)和逆轉(zhuǎn)作用，在細(xì)胞進(jìn)行Lactacystin/MG132誘導(dǎo)前施加200nM的CDNF作用6h，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性分別下降至52.3％和49.7％，與實驗組相比CDNF的神經(jīng)保護(hù)作用均具有統(tǒng)計學(xué)意義（對L

10、actacystin:p＜0.05、對MG132:p＜0.01）;而在細(xì)胞進(jìn)行Lactacystin/MG132誘導(dǎo)后施加200nM的CDNF作用24h，細(xì)胞活性分別下降至59.5％和56.2％，與實驗組相比CDNF的神經(jīng)逆轉(zhuǎn)作用均具有統(tǒng)計學(xué)意義（對Lactacystin:p＜0.05、對MG132:p＜0.01）。其形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其無論細(xì)胞數(shù)量、胞體形態(tài)及核漿界面均較未經(jīng)CDNF處理的要明顯改善。就其胞漿中蓄積的alpha-synuc

11、lein蛋白檢測結(jié)果而言，經(jīng)12.5μM Lactacystin或5μM MG132誘導(dǎo)24h后，其細(xì)胞內(nèi)alpha-synuclein熒光光密度定量檢測分別為2.1755和2.8990。在Lactacystin/MG132誘導(dǎo)前經(jīng)200nM的CDNF作用6h，其表達(dá)alpha-synuclein的細(xì)胞數(shù)量減少，其熒光光密度分別下降至1.3871和1.1710，較實驗組其光密度值下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);而在細(xì)胞進(jìn)行Lacta

12、cystin/MG132誘導(dǎo)后施加200nM的CDNF作用24h，其熒光光密度分別下降至1.4899和1.2958，較實驗組其光密度值下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　研究二、CDNF對蛋白酶體表達(dá)以及水解酶活性的調(diào)控作用
　　就26s蛋白酶體表達(dá)而言，通過MTT法檢測，PC12細(xì)胞經(jīng)12.5μM Lactacystin或5μM MG132誘導(dǎo)24h后，其26s蛋白酶體活性分別，較正常的未處理細(xì)胞組具有統(tǒng)計學(xué)意義(p

13、＜0.05)。為了探討索CDNF對蛋白酶體表達(dá)的作用，在細(xì)胞進(jìn)行Lactacystin/MG132誘導(dǎo)前施加200nM的CDNF作用6h，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)26s蛋白酶體表達(dá)明顯上調(diào)，較實驗組具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而且MG132組較Lactacystin組作用更明顯，但無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05);而在細(xì)胞進(jìn)行Lactacystin/MG132誘導(dǎo)后施加200nM的CDNF作用24h，檢測發(fā)現(xiàn)MG132組的26s蛋白酶體表達(dá)上調(diào)

14、明顯，較實驗組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，而Lactacystin組上調(diào)不明顯，較實驗組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)。就其蛋白酶體中的三種水解酶而言，實驗組的三種水解酶較未處理組而言均下降明顯，與未處理組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。為了探討索CDNF對蛋白酶體中三種水解酶（谷氨酰肽水解酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶）表達(dá)的作用，在Lactacystin/MG132誘導(dǎo)前后分別加入200nM的CDNF進(jìn)行干預(yù)。檢測結(jié)果顯示CD

15、NF對MG132與Lac誘導(dǎo)的谷氨酰肽水解酶均有保護(hù)作用(p＜0.05)，而且二者之間的作用程度無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05);CDNF對谷氨酰肽水解酶均有逆轉(zhuǎn)作用(p＜0.05)，且MG132相較Lactacystin而言作用更明顯(p＜0.05)。CDNF對MG132誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞糜蛋白酶有保護(hù)作用(p＜0.05)，而對Lactacystin誘導(dǎo)的糜蛋白酶無保護(hù)作用(p＞0.05);CDNF對糜蛋白酶沒有逆轉(zhuǎn)作用(p＞0.05)，

16、盡管MG132相比Lactacystin而言作用更明顯。CDNF對Lactacystin所抑制的胰蛋白酶無保護(hù)作用無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，而對MG132所作用的胰蛋白酶具有保護(hù)作用具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，但是對二種蛋白酶體抑制劑所作用的胰蛋白酶無逆轉(zhuǎn)作用(p＞0.05)。
　　結(jié)論:1.CDNF對MG132/Lactacystin所誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞變性具有保護(hù)和逆轉(zhuǎn)作用，而且二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異;
　　2.C

17、DNF對MG132/Lactacystin誘導(dǎo)的26s蛋白酶體具有保護(hù)作用，而MG132比Lac保護(hù)作用更好;CDNF對MG132作用的26s蛋白酶體具有逆轉(zhuǎn)作用，而對Lac作用的26s蛋白酶體無逆轉(zhuǎn)作用;
　　3.CDNF對MG132/Lacatacystin誘導(dǎo)的谷氨酰肽水解酶均有保護(hù)作用，二者之間無統(tǒng)計學(xué)差異;CDNF對谷氨酰肽水解酶均有逆轉(zhuǎn)作用，MG132比Lac具有統(tǒng)計學(xué)意義;
　　4.CDNF對MG132所抑制的