層層自組裝與點(diǎn)擊化學(xué)修飾納米纖維制備“免疫調(diào)節(jié)”支架.pdf

1、可植入性醫(yī)用材料，包括組織工程與藥物釋放支架，目前的研究重點(diǎn)都放在力學(xué)強(qiáng)度、功能組分、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、生物可降解性與表面化學(xué)性質(zhì)等特性方面。但是，在臨床應(yīng)用中，決定移植成敗的是組織重建過程中的免疫排斥反應(yīng)。特別是納米纖維這種具有超高比表面積的組織工程支架，往往會(huì)因?yàn)榉翘禺愋晕酱罅康牡鞍锥鹇匝装Y，形成膠原纖維囊而導(dǎo)致功能喪失。目前的研究表明早期炎癥中巨噬細(xì)胞的分化對(duì)調(diào)節(jié)宿主免疫排斥反應(yīng)、調(diào)控移植物與宿主的整合至關(guān)重要。不同于其他免疫細(xì)胞

2、（例如 T淋巴細(xì)胞）的高度分化狀態(tài)，巨噬細(xì)胞的M1/M2表型具有功能可塑性，可以根據(jù)微環(huán)境信號(hào)的類型、濃度、及持續(xù)時(shí)間的改變而進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)整。本研究的主要內(nèi)容為通過層層自組裝的方式在納米纖維表面修飾絲素蛋白（Silk Fibroin，SF），降低材料的非特異性吸附，并通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將肝素寡糖（Heparin Disaccharide，HD）固定于納米纖維表面用于特異性吸附細(xì)胞因子白介素4(Interleukin-4，IL-4）來主動(dòng)調(diào)控

3、巨噬細(xì)胞的功能分化以降低植入體的免疫排斥反應(yīng)，主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下：
　?、偻ㄟ^靜電紡絲制備聚己內(nèi)酯（poly-ε-caprolactone，PCL）納米纖維，并通過層層自組裝和點(diǎn)擊化學(xué)的方式修飾納米纖維。掃描電鏡、共聚焦熒光顯微鏡、力學(xué)測試、厚度測試的結(jié)果顯示 SF的自組裝修飾不改變納米纖維的整體結(jié)構(gòu)，但隨著組裝層數(shù)的增加，納米纖維的厚度增加；同時(shí)組裝過程中的90％甲醇處理增加了SF的β折疊，最終增加了納米纖維的力學(xué)強(qiáng)度。紅外

4、與紫外光譜的結(jié)果顯示通過點(diǎn)擊化學(xué)的方式在納米纖維表面固化HD具有可行性，固化后的納米纖維表面可以觀察到糖類的紅外特征峰。接觸角測試結(jié)果表明并且HD還能改善納米纖維的親水性。蛋白吸附分析結(jié)果表明SF的修飾降低了納米纖維的非特異蛋白吸附，而HD固化后可以特異性的結(jié)合細(xì)胞因子IL-4，為其調(diào)控免疫排斥反應(yīng)打下良好的基礎(chǔ)。
　?、谠隗w外（in vitro）和體內(nèi)（in vivo）驗(yàn)證了IL-4作為免疫調(diào)節(jié)因子對(duì)納米纖維支架M1/M2型巨噬

5、細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)能力。免疫熒光和免疫組化結(jié)果證明，在炎癥反應(yīng)的開始階段，IL-4具有“功能性”激活巨噬細(xì)胞的能力，之后迅速地將M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為M2型巨噬細(xì)胞。HE染色和MASSON膠原染色結(jié)果證明巨噬細(xì)胞的早期功能調(diào)節(jié)可以抑制免疫排斥反應(yīng)，減少膠原纖維囊的產(chǎn)生。本研究首次將HD應(yīng)用于納米纖維的表面功能化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HD除了作為“橋梁”調(diào)節(jié)所綁定的細(xì)胞因子活性外，自身對(duì)巨噬細(xì)胞也有直接的調(diào)節(jié)作用，會(huì)降低巨噬細(xì)胞的極化從而減少免疫細(xì)胞的

6、招募。
　?、弁ㄟ^RNA轉(zhuǎn)錄組測序探討巨噬細(xì)胞在納米纖維上的分化機(jī)理。轉(zhuǎn)錄組整體質(zhì)量評(píng)估，PCR驗(yàn)證結(jié)果表明本次測序分析準(zhǔn)確可靠，具有參考性。差異基因GO富集分析結(jié)果表明納米纖維影響巨噬細(xì)胞代謝、凋亡、周期、信號(hào)傳遞、免疫功能等行為。KEGG信號(hào)通路富集與可視化的分析結(jié)果表明TNF信號(hào)通道、PI3K-Akt信號(hào)通道、MAPK的JNK和ERK信號(hào)通道以及NF-κB的反饋機(jī)制在納米纖維調(diào)控巨噬細(xì)胞分化不同表型中起到重要作用，為后續(xù)研究