基于轉(zhuǎn)錄組測序的紫外線促進(jìn)鞘蕊蘇有效成分isoforskolin合成機制研究.pdf

1、鞘蕊蘇藥材的植物名為毛喉鞘蕊花（Coleus forskohlii(Willd.) Briq.）系唇形科（Labiatae）鞘蕊花屬（Coleus Lour.）植物，主產(chǎn)于印度、尼泊爾、巴基斯坦、斯里蘭卡、緬甸、泰國等南亞國家；我國云南、福建、臺灣等地亦有分布，被植物學(xué)家界定為珍稀植物。民間將該藥材用于治療哮喘、咳嗽等疾患，療效顯著，稱為“神藥”?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，鞘蕊蘇的有效成分半日花烷型二萜類化合物，我國產(chǎn)鞘蕊蘇的有效成分為異佛司可

2、林（isoforskolin），并將其定為指標(biāo)性成分。
　　鑒于鞘蕊蘇獨特藥效作用，本實驗室與湖北福人藥業(yè)股份有限公司實施產(chǎn)學(xué)研結(jié)合，以鞘蕊蘇為君藥，配伍前胡、甘草組方，將其開發(fā)為―鞘蕊蘇膠囊‖中藥新品種，獲得生產(chǎn)批號（批件號：2011S00365）。為了解決鞘蕊蘇膠囊產(chǎn)業(yè)化所需原料藥材的供求問題，實驗室與湖北福人藥業(yè)股份有限公司合作，從云南會澤縣引種鞘蕊蘇至湖北通城縣規(guī)范化種植。針對通城種植鞘蕊蘇藥材的主要二萜類成分 isofo

3、rskolin含量偏低的問題，本論文對該藥用植物二萜類成分的生物合成機制進(jìn)行了研究，以期為通城種植鞘蕊蘇培育優(yōu)良種質(zhì)；并進(jìn)行了紫外線照射采收的鞘蕊蘇藥材，誘導(dǎo)其主要有效成分 isoforskolin增加的生物合成機制研究，以期為促進(jìn)種植鞘蕊蘇主要有效成分的生物合成和積累提供科學(xué)依據(jù)，并為通過遺傳改良手段培育鞘蕊蘇優(yōu)良種質(zhì)提供基礎(chǔ)，也為二萜化合物的代謝機制的深入研究提供重要信息。
　　本研究的主要研究結(jié)果如下：
　　1.基于I

4、llumina HiSeq高通量測序的鞘蕊蘇轉(zhuǎn)錄組分析
　　以通城縣種植基地的鞘蕊蘇為試驗材料，于10月下旬采集該藥材的葉和根作為供試品，采用HiSeq技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得36Gb轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，拼接后得到422,761條高質(zhì)量序列；對組裝的Unigene基因進(jìn)行預(yù)測，獲得CDS序列和Protein序列；采用Trinity和TGICL的方法從頭組裝、序列拼接和去冗余處理，得到291,061個Unigene基因，平均長度629 bp

5、；將所得Unigene基因與Nr、Swiss-Prot、KEGG和COG公共蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，140,228(48.19％)的 Unigene基因能夠獲得注釋信息。將140,228個注釋信息的Unigene基因進(jìn)行GO和COG聚類分析及KEGG代謝通路分析，86,578條Unigene基因獲得COG功能注釋，被歸類為25個功能分類；共有186,957條Unigene基因獲得GO功能注釋，被歸入到49個GO次級功能分類；共有6,616個

6、Unigene可以分配到261個代謝通路。因此，本項研究為鞘蕊蘇有效成分的萜類合成酶基因克隆，序列分析及表達(dá)研究奠定了基礎(chǔ)，并且根與葉中23個萜類差異基因則為傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因育種的基因調(diào)控靶點提供了研究基礎(chǔ)。
　　2.基于高通量測序的鞘蕊蘇萜類合成酶基因克隆、序列分析及表達(dá)研究
　　在上述高通量基因測序研究基礎(chǔ)上，從注釋信息數(shù)據(jù)中挑選基因片段，采用 RACE技術(shù)進(jìn)行序列分析，獲得三個萜類合成酶的全長 cDNA序列，并通過BL

7、AST和蛋白序列分析。結(jié)果如下：
　?。?）CfGCS基因全長2059bp，包含235bp的5’非編碼區(qū)，1632bp的開放式閱讀框（ORF），192bp的3’非編碼區(qū)，編碼544個氨基酸；對蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，CfGCS相對分子質(zhì)量為63690.84；等電點為5.23；分子式為C2868H4438N738O848S27。qPCR表明CfGCS在鞘蕊蘇葉的表達(dá)量較高。
　?。?）CfVPS基因全長1874bp，包含116b

8、p的5’非編碼區(qū)，1647bp的ORF，111bp的3’非編碼區(qū)；CfVPS相對分子質(zhì)量為63608.40，等電點為5.06，分子式為C2859H4412N744O852S24。以CfVPS為目標(biāo)基因，構(gòu)建表達(dá)載體 PET28-CfVPS，將構(gòu)建好的表達(dá)載體于大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，32℃時誘導(dǎo)6h，菌液上清中有大量表達(dá)。CfVPS參與植物單萜化合物合成，而鞘蕊蘇葉片表面有豐富的腺毛分布，是單萜合成的主要場所，qPCR結(jié)果也表明CfVP

9、S在葉中的表達(dá)量最高。
　?。?）CfGAS基因全長1234bp，包含72bp的5’非編碼區(qū)，993bp的ORF，169bp的3’非編碼區(qū)；CfGAS相對分子質(zhì)量為36895.20，等電點為6.37，分子式為C1672H2575N437O482S12。與山茶花、丹參、番薯零、大麻、煙草、碧冬茄、節(jié)節(jié)麥、小麥進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)CfCPS蛋白與丹參GA蛋白的親緣關(guān)系比較近。同時通過Gateway的方法進(jìn)行GAS過量表達(dá)重組載體構(gòu)建，

10、為后續(xù)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染提供實驗基礎(chǔ)。qPCR結(jié)果表明CfGAS參與赤霉素的合成，赤霉素是二萜類植物激素，在植物的整個生長過程中發(fā)揮著重要作用，在鞘蕊蘇各個組織中均有分布。
　　3.紫外線照射提高鞘蕊蘇藥材有效成分含量的分子機制研究
　　本實驗前期研究表明，通過紫外線照射鞘蕊蘇藥材能提高其二萜類有效成分的含量?；谏鲜銮嗜锾K高通量轉(zhuǎn)錄組研究所獲萜類生物合成酶關(guān)鍵基因的啟示，本論文進(jìn)行了紫外線照射誘導(dǎo)鞘蕊蘇二萜類成分生物合成機制研