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文檔簡介
1、本論文由兩部分組成,第一部分是鞘蕊蘇二萜類生物合成機制,第二部分是蒼術(shù)根莖、葉基因表達差異研究。
第一部分:鞘蕊蘇藥材藥用植物名為毛喉鞘蕊花(Coleus forskohlii(Wild) Briq),系唇形科(Labiatae)鞘蕊花屬植物。野生毛喉鞘蕊花的發(fā)源地為印度次大陸,主要分布在印度、尼泊爾、緬甸、斯里蘭卡、泰國等亞熱帶國家,我國云南會澤、東川等地有少量發(fā)現(xiàn)植物學家界定為稀有物種。民間將該中草藥用于治療哮喘、咳嗽、腫
2、瘤等疾患,療效顯著。鑒于鞘蕊蘇的獨特療效。湖北福人藥業(yè)公司將其開發(fā)為“鞘蕊蘇膠囊”中藥新藥,獲得生產(chǎn)批件【批件號:2011S00365】。為了解決鞘蕊蘇膠囊產(chǎn)業(yè)化所需原料藥材的供求問題,湖北中醫(yī)藥大學劉焱文教授科研團隊與湖北福人藥業(yè)公司產(chǎn)學研結(jié)合,從云南會澤縣移植鞘蕊蘇至湖北通城規(guī)范化種植。本論文對鞘蕊蘇5個二萜合成酶基因,即TPS1、TPS3、TPS4、TPS14和TPS15進行克隆,并且研究其其特異性表達,以期提鞘蕊蘇藥材二萜有效成
3、分的含量,從而為通城種植鞘蕊蘇藥材培育優(yōu)良種質(zhì)提供了科學實驗的依據(jù)。
1、以鞘蕊蘇種子萌發(fā)2周左右的幼苗為試材,提取 RNA并去除 gDNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA,行成克隆模板。以二萜相關(guān)基因不同合成途徑CPS和KS的保守區(qū)域設(shè)計引物,通過引物特異性PCR克隆出保守區(qū)域堿基片段,再通過3’RACE和5’RACE分別進行3’和5’端編碼區(qū)全長的擴增,將測序結(jié)果進行拼接,利用拼接的引物設(shè)計基因全長擴增的引物,再次引物特異性PCR,最終
4、得到基因的全長序列?
2、對CfTPS14、CfTPS15的CDS序列進行生物信息學分析。通過NCBI進行BlastX比對分析,CfTPS14為映式貝殼杉烯合成酶,CfTPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。CfTPS14等電點為5.38,分子式為C3987H6231N1073O1194S42,脂肪系數(shù)為91.35,主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.189,表現(xiàn)為親水性,細胞定位其分布在細胞膜外?CfTPS15等電點為6.86
5、,分子式為 C3633H5629N993O1046S27,脂肪系數(shù)為87.65,主要平均疏水特性(GRAVY)為-0.371,表現(xiàn)為親水性,細胞定位在細胞膜外?
3、針對測序得到的二萜相關(guān)基因保守區(qū)域堿基序列設(shè)計 qPCR引物,設(shè)計原則為擴增長度:100-300 bp;引物長度:18±2;Tm值:54±1℃;引物自身沒有發(fā)卡結(jié)構(gòu),引物之間不易形成二聚體結(jié)構(gòu)。分析結(jié)果表明,CfTPS1為柯巴基焦磷酸異構(gòu)體合成酶,CfTPS3、C
6、fTPS4為丹參酮二烯和13R淚柏醚合成酶, CfTPS14為映式貝殼杉烯合成酶, CfTPS15為映式柯巴基焦磷酸合成酶。CfTPS1和CfTPS3參與鐵銹醇前體丹參酮的合成,故CfTPS1和CfTPS3主要在根和根莖中表達,莖中含量較少;CfTPS3和CfTPS4參與佛斯柯林前體13R淚柏醚的合成,因此CfTPS3主要在根和根莖中表達,CfTPS4可能參與其他催化過程,因此在花和葉中含量較高;CfTPS14和CfTPS15參與次霉素
7、前體映式貝殼杉烯的合成,因此在花和葉中含量較高,在根中含量較低。上述研究表明,qPCR分析結(jié)果與基因特異性表達趨勢基本一致。
4、以CfTPS15基因的CDS設(shè)計引物,并加入 SalⅠ和NotI酶切位點,采用 PCR技術(shù)擴增得到帶有酶切位點的基因 CDS序列,通過酶切位點將 CfTPS15與表載體 Pet28a連接,并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌細胞 BL21,再通過加入適當?shù)恼T導劑IPTG誘導CfTPS15基因的蛋白表達?
第二
8、部分:茅蒼術(shù)Atractylodes lancea(Thunb.) DC.(Compositae菊科),是我國傳統(tǒng)常用藥材。茅蒼術(shù)的根莖具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效。主要有效成分為蒼術(shù)素、β-桉葉醇、蒼術(shù)醇和蒼術(shù)酮等萜類化合物。由于市場對茅蒼術(shù)的需求與日俱增,茅蒼術(shù)野生資源受到掠奪性采挖,導致數(shù)量銳減。因此,人工種植已成為必由之路。而如何提高茅蒼術(shù)根莖產(chǎn)量、保證藥材質(zhì)量是人工種植要解決的首要問題。盡管茅蒼術(shù)的化學成分、藥理學、生理
9、生化、栽培技術(shù)等研究較多,根莖形成和生長的分子機制仍不清楚,很大一部分原因是缺乏茅蒼術(shù)基因組信息。近年來發(fā)展的高通量轉(zhuǎn)錄組技術(shù)為茅蒼術(shù)功能基因組研究提供了有效手段。
1、以江蘇茅山的茅蒼術(shù)為研究對象,對其根莖和葉的轉(zhuǎn)錄組進行測序。構(gòu)建了茅蒼術(shù)總RNA的cDN文庫,采用Illumina HiSeq2000平臺對茅蒼術(shù)的轉(zhuǎn)錄組進行了測序和從頭組裝。通過移除adaptor序列和低質(zhì)量的讀序后,分別從葉和根莖轉(zhuǎn)錄組得到118,397,
10、448和152,688,850 clean reads;總核苷酸數(shù)達33,885,787,250 bp(20 G),平均讀序長度均為125 bp;在所有的茅蒼術(shù)樣品中共計有22,891條unigene表達,其中5,693條、4,502條、6,430條、3,504條和9,296條 unigene分別在2份葉樣品和3份根莖樣品中表達。總共有39,664條序列(占所有unigene總數(shù)的42.90%)與 nr數(shù)據(jù)庫中已知的基因相匹配,這些數(shù)列
11、中的26,159(28.32%)條unigene被歸類到一個或多個GO項下。將 unigene映射到 KEGG數(shù)據(jù)庫的參考代謝通路,總計10,504條unigene被注釋,可歸入289條KEGG代謝途徑;161個Unigenes功能被注解為CYP450s,屬于71 CYP家族類;92366個Unigenes中確定了10103個SSR,其中1074個Unigenes包含兩個以上的微衛(wèi)星D NA,而且406個SSR存在于復合形式。
12、 2、茅蒼術(shù)葉和根莖轉(zhuǎn)錄組的特異性表達分析。在葉和根莖中轉(zhuǎn)錄豐度高的(FPKM>1000)的基因分別有227條和105條,其中有47條在兩種組織中共存。GO富集分析中,4,982DEGs映射到GO數(shù)據(jù)庫中,共有262個 GO項目明顯富集。KEGG富集分析表明,1,158條上調(diào)的unigene與159條KEGG途徑相關(guān)聯(lián),其中29條unigene歸于植物激素信號傳導(ko04075),而多數(shù)unigene與淀粉和糖代謝(ko00500)、
13、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(ko04141)和氨基酸的生物合成(ko01230)相關(guān)。將茅蒼術(shù)的測序結(jié)果與AGRIS數(shù)據(jù)庫中比對,鑒別出42個轉(zhuǎn)錄因子家族;葉中共有60個轉(zhuǎn)錄子上調(diào),根莖中共有67個轉(zhuǎn)錄子上調(diào)。
3、選擇20個差異性表達基因(DEGs)的qPCR驗證RNA測序和計算結(jié)果表明,所有選擇的基因 qPCR相對表達量和轉(zhuǎn)錄組分析具有相同的趨勢。測試了這些基因的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)它們之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)達到0.81。
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