白毒鵝膏菌漆酶的純化、性質(zhì)及偶氮染料降解研究.pdf

1、論文首先從液體培養(yǎng)體系出發(fā)，探索不同培養(yǎng)條件對(duì)白毒鵝膏菌分泌漆酶的影響。我們篩選出白毒鵝膏菌的綜合產(chǎn)酶培養(yǎng)基為(g/L)：馬鈴薯200g/L、麩皮20g/L、KH2PO4 3g/L、MgSO4 1.5g/L、VB1 0.01g/L、酵母膏5g/L。其最佳pH值范圍為5.0-5.4，轉(zhuǎn)速為120rpm，溫度為25℃，裝液量為50-mL。按此條件進(jìn)行培養(yǎng)，漆酶從第5d酶活力迅速提升，第8d達(dá)產(chǎn)酶高峰，隨后產(chǎn)酶能力下降。 實(shí)驗(yàn)通過鹽

2、析、透析、DEAE-纖維素DE52離子交換層析和Sephedex G-100凝膠過濾層析等步驟，分離純化得到電泳純的漆酶。以鄰聯(lián)甲苯胺作為底物，最終漆酶被純化了22.03倍，活力回收率為22.02％。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，漆酶的相對(duì)分子量為63kDa。 該酶具有較寬的pH值穩(wěn)定性，在pH 3.6到5.2范圍內(nèi)能夠較好地保持酶活力：該漆酶最適反應(yīng)溫度為20℃，在20℃到60℃范圍內(nèi)能夠穩(wěn)定的保持較長時(shí)間，但在70℃

3、時(shí)保持5min，且能保持20％的活力。β-巰基乙醇或L-半胱氨酸是該酶的高效抑制劑，但是EDTA或DMSO對(duì)其抑制作用不是很強(qiáng)。白毒鵝膏菌漆酶催化反應(yīng)符合Miehaelis-Menten動(dòng)力學(xué)規(guī)律。在20℃，pH4.6的醋酸緩沖溶液中，漆酶以鄰聯(lián)甲苯胺作為底物時(shí)，米氏常數(shù)為66.7μmol/L。潛在的抑制劑測試中，L-半胱氨酸及2-巰基乙醇在所試濃度范圍內(nèi)均完全抑制漆酶的活力,SDS高濃度時(shí)對(duì)漆酶的活力高度抑制，EDTA和DMSO在所試

4、濃度范圍內(nèi)對(duì)漆酶的活力微弱抑制。 利用白毒鵝膏菌漆酶可以較為徹底的降解6種染料，底物范圍較廣，在降解過程中，要持續(xù)通氧氣(振蕩)。直接黑G降解的最適pH值為5.2，而中性深黃GL降解的最適pH值為3.5。兩種染料與白毒鵝膏菌漆酶作用的最適溫度均為50℃。底物染料濃度為20mg/mL，酶活力超過10U/mL，后，進(jìn)一步提高酶活力對(duì)rD基本無影響，中性深黃GL總脫色率維持在80％左右，直接黑G約維持在60％。 采用海藻酸

5、鈉包埋法和海藻酸鈉-殼聚糖包埋-交聯(lián)法固定化漆酶。探討了固定化條件、固定化漆酶及游離酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明，包埋法和包埋-交聯(lián)法固定化漆酶的最佳條件分別為海藻酸鈉濃度3％、CaCl2濃度1.5％和海藻酸鈉濃度2％、CaCl2濃度2％、殼聚糖濃度1.5％、戊二醛濃度1％。兩種固定化漆酶的最適pH和最適溫度相同，分別為5.0和30℃，游離酶為4.6和20℃。將固定化酶應(yīng)用在偶氮染料的脫色中，包埋法脫色效果接近游離酶并且在重復(fù)進(jìn)行的搖床實(shí)驗(yàn)中