基于雙室培養(yǎng)系統(tǒng)構(gòu)建含天然鈣化層仿生組織工程骨軟骨.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 含天然鈣化軟骨層仿生組織工程骨軟骨支架的制備及檢測(cè)
　　目的：
　　本部分研究中，我們鉆取正常豬膝關(guān)節(jié)股骨髁負(fù)重面骨軟骨柱，削去骨柱透明軟骨部分。切下的透明軟骨用于Ⅱ型膠原蛋白提取，而含鈣化軟骨層的軟骨下骨柱行脫細(xì)胞處理。然后將提取的Ⅱ型膠原蛋白水凝膠接種于鈣化層之上，經(jīng)過凍干及交聯(lián)等步驟，獲得含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架，并對(duì)支架相關(guān)特性進(jìn)行檢測(cè)。
　　方法：
　

2、　1.含天然鈣化軟骨層骨柱的制備及檢測(cè)
　　(1)鉆取直徑為12 mm的含有天然鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)的骨柱，削去透明軟骨層;
　　(2)Triton X-100脫去骨柱中的細(xì)胞;
　　(3)HE染色及DAPI染色觀察骨柱中細(xì)胞是否洗脫干凈。
　　2.Ⅱ型膠原蛋白水凝膠的制備
　　(1)獲取透明軟骨粉;
　　(2)胃蛋白酶消化，鹽析及透析。
　　3.骨軟骨支架的制備及檢測(cè)
　　(1)三維打印構(gòu)建骨

3、軟骨支架制備模具;
　　(2)通過模具在脫細(xì)胞骨支架上灌注Ⅱ型膠原蛋白水凝膠，再通過凍干、交聯(lián)等步驟制備骨軟骨支架;
　　(3)檢測(cè)支架孔隙率、孔徑、細(xì)胞毒性及結(jié)構(gòu)特征。
　　結(jié)果：
　　構(gòu)建的骨軟骨支架呈深藍(lán)色，細(xì)胞洗脫徹底，Ⅱ型膠原蛋白海綿支架平均孔隙率為(96.1±3.8)％，掃描電鏡下測(cè)其孔徑平均大小為(102.3±35.3)μm，脫細(xì)胞軟骨下骨支架的平均孔隙率為(73.5±2.6)％，其平均孔徑大小為(

4、470.2±158.8)μm，呈多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙結(jié)構(gòu)良好，孔孔相通。支架浸提液對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無明顯影響。
　　第二部分 含天然鈣化軟骨層仿生支架雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的構(gòu)建
　　目的：
　　本部分研究中，為了給軟骨層及軟骨下骨層提供獨(dú)立的培養(yǎng)微環(huán)境，我們?cè)O(shè)計(jì)了基于鈣化軟骨層的雙室培養(yǎng)系統(tǒng)，利用鈣化軟骨層的隔離帶作用，為軟骨腔及軟骨下骨腔分別提供成軟骨及成骨培養(yǎng)基。在成軟骨及成骨的環(huán)境中，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分別向軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞的方

5、向分化。這種雙室培養(yǎng)系統(tǒng)更加符合骨軟骨組織的生理特征，因此可能構(gòu)建出更加仿生的骨軟骨缺損修復(fù)材料。
　　方法：
　　1.雙室培養(yǎng)裝置的構(gòu)建
　　(1)運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)技術(shù)設(shè)計(jì)雙室培養(yǎng)系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)三維模型;
　　(2)運(yùn)用三維打印技術(shù)制備雙室培養(yǎng)系統(tǒng)各部件;
　　(3)組裝雙室培養(yǎng)系統(tǒng)，并進(jìn)行密閉性測(cè)試，Co60輻照滅菌。
　　2.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)
　?、裥湍z原酶消化法獲取人羊膜間充質(zhì)干細(xì)

6、胞，差速消化法進(jìn)行純化。
　　3.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合支架共培養(yǎng)
　　(1)CFDA SE及DiI標(biāo)記人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞;
　　(2)細(xì)胞懸液接種法及凝膠接種法接種CFDA SE標(biāo)記的細(xì)胞于膠原層，DiI標(biāo)記的細(xì)胞于軟骨下骨層，并進(jìn)行雙室培養(yǎng);
　　(3)通過病理切片、熒光定量PCR、支架總DNA含量檢測(cè)等手段，檢測(cè)支架中細(xì)胞粘附、生長(zhǎng)、增殖、分布及分化情況。
　　結(jié)果：
　　雙室培養(yǎng)7天后，熒光顯

7、微鏡下可觀察到膠原層CFDA SE標(biāo)記的綠色熒光細(xì)胞，軟骨下骨層DiI標(biāo)記的紅色熒光細(xì)胞，綠色熒光細(xì)胞與紅色熒光細(xì)胞分別位于鈣化軟骨層兩邊，無跨鈣化層細(xì)胞遷移現(xiàn)象。熒光定量PCR檢測(cè)膠原層內(nèi)種子細(xì)胞的成軟骨標(biāo)志物隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，軟骨下骨層內(nèi)種子細(xì)胞的成骨標(biāo)志物隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加。支架中種子細(xì)胞總DNA含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加，因此表明隨著雙室培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，支架內(nèi)種子細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加。
　　第三部分 骨軟

8、骨支架動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　目的：
　　在前面的研究基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步驗(yàn)證該含天然鈣化層仿生骨軟骨支架對(duì)關(guān)節(jié)骨軟骨損傷的修復(fù)效果。在本部分研究中我們選擇貴州小香豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過手術(shù)方法行膝關(guān)節(jié)股骨髁負(fù)重面骨軟骨缺損造模。植入經(jīng)雙室培養(yǎng)的含天然鈣化層的仿生骨軟骨支架，觀察其修復(fù)效果，并與空白對(duì)照及無天然鈣化層仿生骨軟骨支架的修復(fù)效果進(jìn)行對(duì)比。
　　方法：
　　1.含天然鈣化層仿生骨軟骨支架雙室培養(yǎng)
　　(1)Per

9、coll密度梯度離心法獲取豬BMSCs;
　　(2)復(fù)合支架進(jìn)行雙室培養(yǎng)。
　　2.骨軟骨缺損造模及修復(fù)
　　(1)30頭貴州小香豬隨機(jī)分為3組，每組20膝，共60膝;
　　(2)造模，A組為空白對(duì)照組（單純骨軟骨缺損）;B組為不含鈣化層骨軟骨支架修復(fù)組;C組為含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復(fù)組;
　　3.修復(fù)效果評(píng)估
　　體視顯微鏡觀察，核磁共振檢查，HE染色，固綠—番紅O染色，天狼星紅染色及O'Dr

10、iscoll組織學(xué)評(píng)分評(píng)估骨軟骨缺損修復(fù)效果。
　　結(jié)果：
　　與空白對(duì)照及不含鈣化層骨軟骨支架相比，含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架在修復(fù)骨軟骨缺損中具有良好的修復(fù)效果。含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架修復(fù)組中軟骨下骨層修復(fù)組織與宿主組織無明顯差異，可見完整的鈣化軟骨層結(jié)構(gòu)。但軟骨缺損部位仍有部分凹陷，修復(fù)組織表面并未與關(guān)節(jié)表面平齊。
　　結(jié)論:
　　通過低溫凍干及京尼平交聯(lián)技術(shù)，利用含天然鈣化軟骨層脫細(xì)胞骨基質(zhì)及Ⅱ型膠原

11、蛋白水凝膠可構(gòu)建出含完整鈣化層結(jié)構(gòu)的三層仿生骨軟骨支架，該支架結(jié)構(gòu)良好，無明顯細(xì)胞毒性。其鈣化軟骨層具有生理性隔離帶作用，利用其生理性隔離帶作用，我們構(gòu)建的雙室培養(yǎng)系統(tǒng)能為軟骨層及軟骨下骨層提供獨(dú)立的生長(zhǎng)微環(huán)境。種子細(xì)胞在含天然鈣化軟骨層骨軟骨支架中生長(zhǎng)良好，在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的作用下，軟骨層及軟骨下骨層中的間充質(zhì)干細(xì)胞可分別向成軟骨及成骨方向分化，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，支架內(nèi)種子細(xì)胞含量逐漸增加。在骨軟骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照及不含