軟骨組織工程種子細(xì)胞應(yīng)用策略及耳廓軟骨組織構(gòu)建研究.pdf

1、研究背景及意義：
　　 耳廓軟骨組織工程為耳軟骨缺損的修復(fù)重建提供了新的治療思路，其中種子細(xì)胞是限制其發(fā)展及臨床應(yīng)用的瓶頸之一。目前，構(gòu)建組織工程軟骨主要通過三種方式來實(shí)現(xiàn)：(1)單獨(dú)應(yīng)用各種來源的軟骨細(xì)胞；(2)單獨(dú)應(yīng)用成軟骨誘導(dǎo)后的間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymalstemcells，MSCs）；(3)將軟骨細(xì)胞與MSCs混合共培養(yǎng)。上述三類種子細(xì)胞應(yīng)用方案從細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用的角度上講各存利弊，但目前尚缺乏關(guān)于此類

2、問題的深入探討；此外，針對(duì)先天性小耳畸形，自體殘耳組織是外耳重建重要的種子細(xì)胞來源，目前對(duì)殘耳組織來源細(xì)胞及其軟骨構(gòu)建系統(tǒng)化的研究較少，確立最佳的種子細(xì)胞應(yīng)用策略能夠?yàn)槎浌墙M織工程突破目前困境及發(fā)展未來應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。
　　 研究目的：
　　 1、通過在組織學(xué)、基因表達(dá)及生物學(xué)功能等方面系統(tǒng)比較單純應(yīng)用軟骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞與BMSCs混合共培養(yǎng)、BMSCs成軟骨誘導(dǎo)三類種子細(xì)胞應(yīng)用方案，確立構(gòu)建彈性軟骨最佳

3、的種子細(xì)胞應(yīng)用策略并探討其構(gòu)建耳廓形態(tài)軟骨的可行性。
　　 2、通過分析殘耳軟骨細(xì)胞的體外增殖、表型變化、細(xì)胞組織的量效關(guān)系以及研究傳代、誘導(dǎo)對(duì)其體內(nèi)成軟骨能力的影響，確立基于殘耳軟骨細(xì)胞的種子細(xì)胞應(yīng)用策略及其構(gòu)建耳廓形態(tài)軟骨的可行性。
　　 研究?jī)?nèi)容：
　　 1．不同種子細(xì)胞及應(yīng)用方案構(gòu)建組織工程軟骨
　　 1.1、比較不同組織來源軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨的差異
　　 方法：選擇耳廓和關(guān)節(jié)兩種不

4、同組織來源的軟骨細(xì)胞接種PGA/PLA支架構(gòu)建組織工程軟骨組織，在其體外和體內(nèi)的不同構(gòu)建階段，通過組織學(xué)檢測(cè)進(jìn)行觀察，比較兩組構(gòu)建物是否因細(xì)胞的組織來源不同而存在差異。
　　 結(jié)果：耳廓和關(guān)節(jié)來源的軟骨細(xì)胞構(gòu)建的軟骨組織在體外未發(fā)現(xiàn)組織學(xué)水平的差異，但植入皮下6周后均恢復(fù)了各自的生物學(xué)特性，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞組發(fā)生了部分骨化，耳廓軟骨細(xì)胞組出現(xiàn)了彈性纖維的陽性著色。
　　 小結(jié)：體外構(gòu)建的組織工程軟骨植入體內(nèi)后能恢復(fù)軟骨細(xì)胞組

5、織來源的特性，可在皮下構(gòu)建與軟骨細(xì)胞來源類型相同的組織工程軟骨。
　　 1.2、比較三類種子細(xì)胞應(yīng)用方案構(gòu)建組織工程軟骨的差異
　　 方法：系統(tǒng)性比較單獨(dú)應(yīng)用耳廓軟骨細(xì)胞、單獨(dú)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)并對(duì)其進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)、以及耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs混合共培養(yǎng)構(gòu)建的組織工程軟骨在組織學(xué)、基因表達(dá)及生物力學(xué)功能方面存在的差異。
　　 結(jié)果：復(fù)合

6、物在植入體內(nèi)6周后，BMSCs誘導(dǎo)組不僅不能構(gòu)建彈性軟骨組織而且發(fā)生了明顯的骨化，COL10A1、MMP13、ALPL的表達(dá)較其余兩組出現(xiàn)顯著升高；耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs混合共培養(yǎng)組不僅可保持穩(wěn)定的軟骨表型，而且相較單純耳廓軟骨細(xì)胞組其彈性纖維更為均質(zhì)、密集，彈性模量也更高且與生理耳廓軟骨無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，COL9A1、COMP、DCN、LOXL2的表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的升高。此外，共培養(yǎng)構(gòu)建的軟骨組織其Dlk1與Ki67的表達(dá)也高于單純耳

7、廓軟骨細(xì)胞組。
　　 小結(jié)：耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs混合共培養(yǎng)是目前構(gòu)建彈性軟骨組織最佳的種子細(xì)胞應(yīng)用策略，其構(gòu)建的彈性軟骨具備更密集的彈性纖維和更高的彈性模量，并且可延續(xù)干細(xì)胞帶來的增殖與分化能力。
　　 1.3、軟骨細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)構(gòu)建耳廓軟骨
　　 方法：將豬自體耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs以5∶5的比例混合接種于預(yù)成型的耳廓形態(tài)PGA/PLA支架上，體外培養(yǎng)10周，植入豬耳后皮下20周后進(jìn)行軟骨相

8、關(guān)檢測(cè)。
　　 結(jié)果：豬耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs以5∶5的比例混合共培養(yǎng)能夠在體外構(gòu)建良好形態(tài)及彈性的耳廓軟骨，在植入大動(dòng)物體內(nèi)20周后仍然能夠穩(wěn)定存活，且其組織學(xué)與彈性相較生理耳廓軟骨無明顯差異，但是最終難以維持耳廓的精細(xì)形態(tài)。
　　 小結(jié)：在大動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，共培養(yǎng)構(gòu)建的耳廓軟骨能夠穩(wěn)定存活20周，但因不能對(duì)抗皮膚收縮力最終難以維持耳廓的精細(xì)形態(tài)。
　　 2．先天性小耳殘耳軟骨細(xì)胞構(gòu)建組織工程軟骨
　　

9、 2.1、殘耳軟骨細(xì)胞的增殖、表型變化及量效關(guān)系研究
　　 方法：通過對(duì)大量殘耳組織進(jìn)行稱重和細(xì)胞分離計(jì)數(shù)，計(jì)算殘耳組織的初始細(xì)胞獲得率；通過繪制生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞計(jì)數(shù)研究4代以內(nèi)殘耳軟骨細(xì)胞在bFGF影響下的增殖能力及擴(kuò)增倍數(shù)；在細(xì)胞和基因水平檢測(cè)傳代對(duì)殘耳軟骨細(xì)胞表型的影響；并通過大量軟骨相關(guān)基因譜的篩查比對(duì)殘耳軟骨細(xì)胞與正常耳軟骨細(xì)胞在基因水平的異同。
　　 結(jié)果：殘耳組織的初始細(xì)胞獲得率為(3.90±1.27)×1

10、06/g;殘耳軟骨細(xì)胞在bFGF的刺激下增殖能力明顯提高,4代以內(nèi)增殖能力未見差別，且擴(kuò)增至P4代能夠達(dá)到(328.4±50.4)倍的增殖效率；但是，同樣條件下擴(kuò)增至P3代的殘耳軟骨細(xì)胞其番紅O染色、Ⅱ型膠原的基因表達(dá)已較弱，至P4代基本檢測(cè)不到；此外，殘耳軟骨細(xì)胞在基因水平除個(gè)別個(gè)體的COL2A1成熟型異構(gòu)體COL2A1V2及COL9A1的表達(dá)偏低外，與正常耳軟骨細(xì)胞相較未見明顯差異。
　　 小結(jié)：殘耳組織來源細(xì)胞與正常耳廓軟

11、骨細(xì)胞相比在基因水平未見明顯差異，在bFGF培養(yǎng)下增殖到P3代仍可維持一定程度的軟骨表型且能達(dá)到構(gòu)建常人體積耳廓軟骨的細(xì)胞數(shù)量（以獲得500mg殘耳組織計(jì)算）。
　　 2.2、體外傳代及誘導(dǎo)對(duì)殘耳軟骨細(xì)胞體內(nèi)成軟骨能力的影響
　　 方法：將P3-P8代殘耳軟骨細(xì)胞各自接種PGA/PLA支架進(jìn)行軟骨組織構(gòu)建，根據(jù)組織學(xué)、基因表達(dá)和生物力學(xué)結(jié)果分析體外傳代及誘導(dǎo)對(duì)其最終體內(nèi)成軟骨能力的影響。
　　 結(jié)果：在P3-P8

12、各代次細(xì)胞材料復(fù)合物中，P4代以前在體外4周可較高表達(dá)SOX9和DLK1，并能在體內(nèi)形成良好的彈性軟骨組織；經(jīng)過體外誘導(dǎo)，P3-P8代的殘耳軟骨細(xì)胞材料復(fù)合物均能在體外形成類軟骨組織，但DLK1的表達(dá)卻均顯著低于非誘導(dǎo)組，且其體內(nèi)8周后的成骨現(xiàn)象十分明顯。
　　 小結(jié)：P4代以前的殘耳軟骨細(xì)胞不經(jīng)體外誘導(dǎo)雖然不能在體外構(gòu)建耳廓軟骨，但仍可保持良好的體內(nèi)成軟骨能力形成彈性軟骨。P3-P8代細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)可以形成類軟骨組織，但是其體

13、內(nèi)的成骨傾向較為嚴(yán)重，DLK1可能在體外成軟骨誘導(dǎo)致體內(nèi)成骨過程中扮演重要角色。
　　 2.3、單例先天性小耳殘耳軟骨細(xì)胞構(gòu)建常人體積耳廓軟骨
　　 方法：將單例病人殘耳組織分離的軟骨細(xì)胞在體外傳至P3或P4代，在生長(zhǎng)因子、藻酸鹽凝膠、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)的體外再分化系統(tǒng)中培養(yǎng)10周后進(jìn)行軟骨相關(guān)檢測(cè)，以體外普通培養(yǎng)（不誘導(dǎo)）作為對(duì)照。
　　 結(jié)果：利用單例先天性小耳的殘耳組織經(jīng)過細(xì)胞擴(kuò)增和再分化系統(tǒng)培養(yǎng)可以在體外構(gòu)建常人體

14、積的耳廓形態(tài)軟骨，所形成的軟骨組織結(jié)構(gòu)較接近正常生理軟骨組織。
　　 小結(jié)：大量增殖的殘耳軟骨細(xì)胞在再分化誘導(dǎo)系統(tǒng)培養(yǎng)下能夠在體外構(gòu)建常人體積的耳廓軟骨。
　　 綜上所述，本研究以耳廓軟骨構(gòu)建為最終目的，探討了幾種軟骨組織工程種子細(xì)胞及其應(yīng)用策略的可行性。明確了耳廓軟骨細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)方案在構(gòu)建彈性軟骨方面的優(yōu)勢(shì)，首次應(yīng)用其在體外構(gòu)建耳廓形態(tài)組織工程軟骨并進(jìn)行大動(dòng)物體內(nèi)研究。同時(shí)，系統(tǒng)研究了殘耳軟骨細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織