合成PHA相關(guān)基因離子束誘變及其高產(chǎn)突變體分子機(jī)制研究.pdf

1、聚-β-羥基烷酸是微生物代謝過程中產(chǎn)生的貯存物質(zhì)，可被微生物完全降解，是一類新型高分子熱塑材料，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、環(huán)保行業(yè)有著廣闊的應(yīng)用前景。本研究利用低能氮離子注入方法對(duì)出發(fā)菌pCB4進(jìn)行改良，研究了離子注入適宜的技術(shù)參數(shù)，進(jìn)行了產(chǎn)PHA突變體的篩選和突變體遺傳穩(wěn)定性分析，利用PCR技術(shù)和生物信息學(xué)方法分析了突變體的分子機(jī)制，獲得如下主要結(jié)果： 1．采用低能氮離子注入出發(fā)菌pCB4后，呈現(xiàn)出一種先降后升再降的“馬鞍型

2、”劑量存活曲線。確定出發(fā)菌最適注入能量為10keV、注入劑量為7.8x10<'14>N<'+>/cm<'2>。 2．通過多輪誘變篩選，最終獲得了一株高產(chǎn)菌株，并將其命名為pCBH4，對(duì)該菌株進(jìn)行了進(jìn)一步傳代實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株在合成PHA性狀上具有遺傳穩(wěn)定性；通過提取pCBH4突變菌株含合成PHA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化受體菌DH5a，證實(shí)高產(chǎn)PHA是由于質(zhì)粒合成PHA相關(guān)基因突變所致。 3．研究對(duì)所得的PHA樣品進(jìn)行氣相色譜

3、分析。結(jié)果表明，突變體PHA樣品中組分主要為PHB，占41.33％，比對(duì)照提高了48.78％，而樣品中其它成分含量則較少，這說明突變主要利于催化合成PHB。 4．根據(jù)原始序列設(shè)計(jì)引物，從突變株pCBH4中擴(kuò)增出了phaA、phaB和phaC基因，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析，發(fā)現(xiàn)突變體phaA基因在序列末端有七處堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生變化。phaC基因在序列末端有也有七處堿基發(fā)生改變，導(dǎo)致5個(gè)氨基酸發(fā)生改變。堿基突變以顛換為

4、主，顛換頻率為78.57％，轉(zhuǎn)換頻率為21.43％。突變株phaA和phaC基因堿基和氨基酸序列的變異導(dǎo)致DNA及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和部分性質(zhì)的變化，而phaB基因的堿基序列未觀測(cè)到變化。 5. 對(duì)突變株pCBH4的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究。選用蛋白胨作為氮源，當(dāng)接種量為8％，培養(yǎng)基初始pH7.0，搖瓶培養(yǎng)24h，再靜止培養(yǎng)36h時(shí)，能獲得較大的生物量、PHA濃度和PHA含量，分別為2.26g/L， 1.81g/L和80.08％，分別比