脂筏結(jié)構(gòu)拆離與重建的原子力顯微鏡研究.pdf

1、目的：通過(guò)系統(tǒng)的研究人工制備雙層生物膜中卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺的相互作用，從分子動(dòng)力學(xué)角度分析結(jié)構(gòu)形成的原因。研究分子具有的官能團(tuán)在形成結(jié)構(gòu)中作用，從而為組裝生物膜的脂筏結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)。再通過(guò)體外模擬和體內(nèi)分離相結(jié)合的方法，從細(xì)胞中分離脂筏，對(duì)其結(jié)構(gòu)、組成成分、物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，探索脂筏結(jié)構(gòu)和功能的生物學(xué)特性。 方法： 1.利用LB技術(shù)測(cè)試單分子層膜的平均分子面積和表面壓力等溫線，采用Y型提

2、膜方法保持一定的膜壓在新解離的云母片上制備脂雙層膜。 2.用原子力顯微鏡檢測(cè)不同脂成份形成的脂雙層膜結(jié)構(gòu)。 3.通過(guò)蔗糖密度梯度離心，用去垢劑處理質(zhì)膜樣品提取脂筏成份。 結(jié)果： 1.對(duì)于單元系統(tǒng)，磷脂酰膽堿單層膜的等溫線都表現(xiàn)出明顯的相變點(diǎn)，而鞘磷脂、膽固醇沒(méi)有明顯的相變點(diǎn)。原子力顯微鏡觀察到磷脂酰膽堿分子結(jié)構(gòu)容易形成聚團(tuán)的微區(qū)囊泡結(jié)構(gòu)，鞘磷脂則易于形成結(jié)構(gòu)均一的雙層膜結(jié)構(gòu)。膽固醇易于聚團(tuán)，形成片

3、層結(jié)構(gòu)。通過(guò)單元系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，熟悉掌握了制備人工雙層膜系統(tǒng)，為下一步進(jìn)行多元系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2.對(duì)于二元系統(tǒng)系統(tǒng)，等摩爾配比的鞘磷脂(SM)/磷脂酰膽堿(PC)、鞘磷脂(SM)/磷脂酰乙醇胺(PE)和鞘磷脂(SM)/膽固醇(Ch01)表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)特征。SM/PC能形成具有周期性的波紋結(jié)構(gòu)，在較大的膜壓下能形成圓形的微區(qū)結(jié)構(gòu)，飄浮在液態(tài)PC上。在膜壓最大時(shí)，雙層膜表現(xiàn)為穩(wěn)定地片層結(jié)構(gòu)。對(duì)于SM/PE組成的系統(tǒng)，在較低膜壓下

4、，形成了邊界非常明顯的微區(qū)結(jié)構(gòu)，微區(qū)內(nèi)部?jī)山M份形成了聚集體結(jié)構(gòu)。在較大的膜壓情況下，形成大片層和緊密的聚集體結(jié)構(gòu)。而SM/Chol則在低膜壓下形成均一的結(jié)構(gòu)，云母表面的覆蓋率在60％以上，均勻分布，結(jié)構(gòu)鮮明。當(dāng)在較高膜壓時(shí)能形成穩(wěn)定的具有許多孔洞的片層結(jié)構(gòu)。 3.對(duì)于三元系統(tǒng)系統(tǒng)，主要研究了等摩爾配比的SM/Chol/PC、SM/Chol/PE和SM/Chol/：神經(jīng)酰胺(Ceramide)混合物的雙層膜結(jié)構(gòu)特性。同時(shí)研究了不

5、同比例的Chol在SM/PC中的分布。結(jié)果表明，SM/Chol/PC能在中間膜壓情況下形成圓形的結(jié)構(gòu)微區(qū)，SM/Chol形成緊密的液態(tài)有序相，大小約為200nm。在膜壓較高的情況形成了多孔洞的片層結(jié)構(gòu)。對(duì)于SM/Chol/PE不能形成規(guī)則的微區(qū)結(jié)構(gòu)，易于形成脂質(zhì)體小泡狀結(jié)構(gòu)。而SM/Chol/Ceramide在低膜壓下形成均勻的分散的多片層結(jié)構(gòu)，在中間膜壓形成了更加緊密聚集的顆粒結(jié)構(gòu)，顆粒表現(xiàn)為中間低邊緣高的結(jié)構(gòu)特性，這與提出的脂筏結(jié)構(gòu)

6、相似。當(dāng)在SM/PC中逐漸加入Chol時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膽固醇和帶飽和脂肪酸鏈的磷脂發(fā)生相互作用形成微區(qū)結(jié)構(gòu)，隨著膽固醇含量的增加，微區(qū)的面積逐漸增大，形成了穩(wěn)定的片層結(jié)構(gòu)。在三元系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，對(duì)多元系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀測(cè)，研究了不同比例的Ceramide在等摩爾SM/PC/Chol中的分布。隨著神經(jīng)酰胺比例的增加，先形成緊密的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，然后逐漸演變成具有特定微區(qū)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 4．提取細(xì)胞脂質(zhì)成分組裝和脂筏分離的結(jié)構(gòu)檢測(cè)。用蔗糖密

7、度梯度離心法從人血紅細(xì)胞中分離不溶于去垢劑Triton X-100的膜筏成份。原子力顯微鏡三維結(jié)構(gòu)測(cè)定表明單個(gè)脂筏以顆粒聚集體的形式存在，直徑約210nm的扁圓形中間凹陷結(jié)構(gòu)。分離干燥血影成份的LB膜結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為穩(wěn)定的片層和聚集體共存結(jié)構(gòu)，具有特定的結(jié)構(gòu)微區(qū)特性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明體外進(jìn)行細(xì)胞膜脂筏結(jié)構(gòu)模擬組裝與在體分離方面具有相同的結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：LB雙層膜的制備與多種因素有關(guān)，如溫度、pH值、濃度等。不同分子所具有的官能團(tuán)決定了結(jié)構(gòu)