固定CO2富油微藻的選育及基因轉(zhuǎn)化藻株的構(gòu)建研究.pdf

1、人類工業(yè)文明快速發(fā)展，不可避免地排放各種廢氣與污水，污染人類賴以生存的環(huán)境。作為溫室氣體的主要成分，CO2的減排勢在必行，而利用微藻固碳被認為是降低 CO2水平最環(huán)保安全和可持續(xù)的方式。微藻技術(shù)用于煙道氣CO2固定需要克服的最大難題是提高微藻固定CO2的能力，因此最為重要的是獲得十分優(yōu)質(zhì)的藻種，同時，藻株既要具備繁殖快生長快、含油量高、容易回收的生物特性，同時還要具備高耐受性，可以在煙道氣中有毒，有塵，高溫的環(huán)境下生存；同時獲得更多的副

2、產(chǎn)物，比如微藻生物質(zhì)。微擬球藻Nannochloropsis是真核單細胞藻類，具有很高的光合作用效率、生物量和油脂含量。目前，對有些微擬球藻株已建立了成熟的培養(yǎng)體系，多個藻株的全基因組序列業(yè)已公布，在微藻產(chǎn)油工業(yè)化應(yīng)用研究中微擬球藻屬已作為模式研究藻種被國內(nèi)外研究人員廣泛關(guān)注。因此，篩選富油微擬球藻耐受高濃度CO2的藻株，及通過基因工程的手段改良富油微藻的耐受高CO2的能力就變得非常有意義。
　　本研究采用光生物反應(yīng)器以高濃度CO

3、2條件對6株海洋微擬球藻進行了篩選及培養(yǎng)，分析發(fā)現(xiàn)海洋微擬球藻 N.oceanica、鹽生微擬球藻 N.salina和眼點微擬球藻N.oculata這3株微藻可耐受5％CO2，生長良好。N.salina在5%CO2條件時，TAG含量最高，大于10%CO2條件生長受到抑制。在通入CO2條件下培養(yǎng)富含 TAG的淡水湖泊微擬球藻，考察其對亞硝態(tài)氮的耐受性，結(jié)果表明盡管該藻不能耐受很高濃度的CO2(>2%)，但該藻可以在含高濃度亞硝態(tài)氮(1mM

4、 NaNO2)的培養(yǎng)液中正常生長，也是一個在工業(yè)上有應(yīng)用前景的優(yōu)良藻株。在本研究中，我們克隆得到微綠球藻屬的已定種的所有藻株微管蛋白β-tubulin啟動子區(qū)域，并通過電擊轉(zhuǎn)化方法成功轉(zhuǎn)化這個屬的所有5個海水種的6株微藻。另外，建立了基于PCR擴增的雙鏈DNA片段(PCR產(chǎn)物)的轉(zhuǎn)化體系，得到比基于線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化更高的轉(zhuǎn)化效率(10.7?61.2×10-6，1.5?13倍)。成功使用含有非抗性選擇的GUS基因和僅含有選擇標記盒的質(zhì)粒對

5、鹽生微擬球藻N.salina進行共轉(zhuǎn)化，共轉(zhuǎn)化率超過50%。成功構(gòu)建N.gaditana、N.salina及兩株N.oceanica共4株微藻的，分別含有各自內(nèi)源β-tubulin啟動子及碳酸酐酶CA基因的RNAi片段的質(zhì)粒載體 pks-TUBp-CAH2-RNAi，并對4株微擬球藻進行遺傳轉(zhuǎn)化，初步檢測證實抗性基因已經(jīng)插入陽性轉(zhuǎn)化子的基因組中， RT-PCR結(jié)果提示碳酸酐酶CA基因表達下調(diào)，Western Blot分析顯示碳酸酐酶蛋白