甜菊糖苷代謝轉運機制研究.pdf

1、甜菊糖苷，一種貝殼杉烯型四環(huán)二萜類化合物，是天然甜味劑甜菊糖的主要成分之一，已被廣泛應用于食品、飲料、醫(yī)藥等行業(yè)。早期研究表明，甜菊糖不但具有高甜低熱的特性，同時還具有多種藥理活性，如抗高血壓、抗糖尿病、抗齟齒等。本文以甜菊糖主要成分萊鮑迪苷A(RA)、甜菊醇（SV)及其體內主要代謝物葡糖醛酸結合物（SVG)為研究對象，利用微粒體、重組酶、細胞、動物等實驗模型，從體外、體內兩方面闡明其代謝轉運機制，同時基于代謝轉運機制考察甜菊糖與藥物合

2、用時可能產(chǎn)生的潛在相互作用，為其安全合理應用提供依據(jù)。
　　本研究首先建立了快速、靈敏的LC-MS/MS方法用于檢測樣品中SVG的含量。樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白處理后，使用C18色譜柱（2.3x50mm，5pm)進行液相分離，在負離子MRM模式下檢測SVG。線性范圍為2?1000 nM，方法具有良好的重現(xiàn)性。為闡明SV在體內的代謝清除機制，我們利用肝微粒體和腸微粒體對SV的內在清除率進行了考察。首先，對蛋白濃度和孵育時間進行優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，蛋

3、白濃度0.2 mg/ml和反應時間5 min最佳。在人、鼠肝微粒體和腸微粒體四種代謝體系中，SV均能快速發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應生成SVG,且呈現(xiàn)明顯的底物抑制現(xiàn)象。在人和大鼠中，SVG的生成速率相似，但肝微粒體中SVG生成速率顯著高于腸微粒體，提示肝是SV發(fā)生葡萄糖醛酸化反應的主要器官。為進一步闡明SVG在體內的生成機制，本研究利用12種FDA規(guī)定的重組人UGT酶亞型進行底物篩查。結果表明，在苷元濃度為2hM時，UGT2B7可介導SV快

4、速發(fā)生葡萄糖醛酸結合反應，催化生成SVG;當苷元濃度升到20nM時，UGT2B7和UGT1A3均可顯著介導SVG的生成。隨后在兩種重組酶中的動力學進行了考察。結果表明，與微粒體類似，在重組酶中同樣出現(xiàn)了明顯的底物抑制現(xiàn)象。提示UGT2B7是介導人體內SV發(fā)生葡萄糖醛酸化的主要二相代謝酶。考察了人體主要外排轉運體和攝取轉運體是否參與SVG的處置過程。我們首先利用穩(wěn)定表達hMDRl、hBCRP、hMRP2或hMATEl的MDCKII細胞進行

5、雙向轉運實驗。結果顯示，這些外排轉運體對SVG的跨膜轉運無明顯作用。隨后，我們利用穩(wěn)定表達攝取轉運體hOATl、hOAT3、hOCT2、hOATPlA2、hOATPlBl、hOATPlB3或hOATP2Bl的HEK293細胞系進行考察。結果表明，hOAT3及hOATPs對S V G的細胞攝取起重要作用，且h O A T3對S V G的排泄作用遠高于hOATPs，提示hOAT3是介導SVG體內轉運清除的主要轉運體。為了進一步研究是否存在S

6、V與藥物的相互作用，我們對SV與藥物或天然小分子化合物之間的相互作用進行了考察。結果發(fā)現(xiàn)，UGT2B7的底物齊多夫定、氟哌啶醇、雙氯芬酸對SVG生成均有不同程度的抑制作用，其中以雙氯芬酸的抑制作用最強，Ki為4.2pM,屬于競爭性抑制。并且，SV可反作用于雙氯芬酸，抑制其代謝清除。提示S V與雙氯芬酸之間可能存在UGT2B7介導的相互作用?；谵D運體介導的相互作用研究發(fā)現(xiàn)，多種藥物和天然小分子化合物可顯著抑制SVG的細胞攝取，尤其是hO

7、AT3及hOATPlB3介導的細胞攝取。其中，抑制作用最強的是槲皮素、替米沙坦、雙氯芬酸和桑皮黃素，對hOAT3的攝取抑制作用IC5Q值分別為1.82^M、2.92|xM、8.01\iM和9.97\iMo。在大鼠原代肝細胞中的研究表明，SVG可顯著被原代肝細胞攝取，替米沙坦及桑皮黃素可顯著抑制這一過程，且具有明顯的濃度依賴性，IC5。值分別為2.0 pM和7.1 mM。大鼠體內相互作用研究發(fā)現(xiàn)，同時灌胃給予大鼠RA(15 mg/kg)和