基于多基因位點(diǎn)的長(zhǎng)江流域及淮河流域沙塘鱧屬魚類遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、本研究采集了17個(gè)地理種群163尾個(gè)體的沙塘鱧屬（Odontobutis）魚類，依次為中華沙塘鱧5個(gè)種群：宜都種群（YiDou population，簡(jiǎn)稱“YD”）8尾、宜昌當(dāng)陽(yáng)種群（DangYang population，簡(jiǎn)稱“DY”）10尾、荊州種群（JingZhou population，簡(jiǎn)稱“JZ”）10尾、岳陽(yáng)洪湖種群（HongHu population，簡(jiǎn)稱“HH”）6尾和鷹潭種群（Yingtan population，簡(jiǎn)稱

2、“YT”）10尾；河川沙塘鱧12個(gè)種群分別為：六安種群（LuAn population，簡(jiǎn)稱“LA”）10尾、巢湖種群（ChaoHu population，簡(jiǎn)稱“CH”）10尾、宣城種群（XuanCheng population，簡(jiǎn)稱“XC”）10尾、黃山種群（HuangShang population，簡(jiǎn)稱“HS”）9尾、淮安種群（HuaiAn population，簡(jiǎn)稱“HA”）10尾、揚(yáng)州種群（YangZhou populatio

3、n，簡(jiǎn)稱“YZ”）10尾、高郵種群（GaoYou population，簡(jiǎn)稱“GY”）10尾、靖江種群（JingJiang population，簡(jiǎn)稱“JJ”）10尾、湖州九里橋種群（HuZhou Jiuliqiao population，簡(jiǎn)稱“HZJ”）10尾、湖州太湖種群（HuZhou Taihu population，簡(jiǎn)稱“HZT”）10尾、蘇州種群（SuZhou population，簡(jiǎn)稱“SZ”）10尾和上海種群（ShangH

4、ai population，簡(jiǎn)稱“SH”）10尾。通過(guò)線粒體分子標(biāo)記（線粒體全長(zhǎng)與D-loop區(qū)）和核基因標(biāo)記（3個(gè)EPICs標(biāo)記與微衛(wèi)星標(biāo)記）的擴(kuò)增，分析了我國(guó)長(zhǎng)江流域及淮河流域沙塘鱧屬魚類的種群遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)，并探討了這種遺傳多樣性差異性分布的空間格局成因以及與地理環(huán)境之間的關(guān)系。
　　主要結(jié)果如下:
　　1.長(zhǎng)江流域沙塘鱧屬魚類線粒體基因組重排與分子標(biāo)記篩選
　　采用引物步移法PCR擴(kuò)增，獲得全長(zhǎng)為1684

5、6bp的河川沙塘鱧(Odontobutis potamophila)線粒體全基因組（mtDNA），并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、重排機(jī)制及在系統(tǒng)發(fā)育中的應(yīng)用進(jìn)行了分析。主要結(jié)果為：
　　(1)河川沙塘鱧mtDNA由37個(gè)基因和一個(gè)非編碼控制區(qū)組成；除ND6和8個(gè)tRNAs外，其他基因都編碼在重鏈(H)上；tRNA基因因發(fā)生滑移重排(shuffling)，將經(jīng)典的線粒體基因組HSL(tRNAHis-tRNAser-tRNALeu)排序變成了SLH

6、(tRNAser-tRNALeu-tRNAHis)排列，造成在tRNALeu與tRNAHis、ND4與tRNASer之間分別插入了320bp和42bp的兩個(gè)“匿名區(qū)”。
　?。?）檢測(cè)的112種鱸形目(Perciformes)魚類中，僅有13種(11.61％)發(fā)生了mtDNA基因重排現(xiàn)象，而沙塘鱧屬的中華沙塘鱧(O. sinensis)、平頭沙塘鱧(O. platycephala)與河川沙塘鱧的基因重排位置一致，揭示其可能是沙塘鱧

7、屬魚類進(jìn)化過(guò)程中的一個(gè)重要分子“標(biāo)簽”。
　?。?）ND4和ND5為兩個(gè)可用于蝦虎魚亞目(Gobioidei)魚類科階元水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重建的合適分子標(biāo)記。
　　2.基于線粒體控制區(qū)的長(zhǎng)江流域及淮河流域沙塘鱧屬魚類種群遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)分析
　　從YD、DY、JZ、HH和YT等5個(gè)中華沙塘鱧種群，采集44尾個(gè)體；從LA、CH、XC、HS、HA、YZ、GY、JJ、HZJ、HZT、SZ和SH等12個(gè)河川沙塘鱧種群，

8、采集119尾個(gè)體，擴(kuò)增線粒體控制區(qū)（D-loop）1041bp，分析時(shí)去除兩端測(cè)序錯(cuò)誤和比對(duì)缺失區(qū)（missing data）后，選取906bp序列用于遺傳學(xué)分析，結(jié)果如下：
　　(1)遺傳多樣性分析。中華沙塘鱧有73個(gè)變異或多態(tài)位點(diǎn)（8.06%），44條堿基序列可定義22個(gè)單倍型，其中H6為共享單倍型（34.09%）；河川沙塘鱧有21個(gè)變異或多態(tài)位點(diǎn)（2.32%），119條堿基序列可定義12個(gè)單倍型，共享單倍型為H11（63.8

9、6%）、H16（3.36%）與H18（10.08%），河川沙塘鱧單倍型較為貧乏。
　　(2)種群遺傳多樣性分析。中華沙塘鱧種群的平均單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（π）依次為0.7197和0.0057；而河川沙塘鱧的為0.1796和0.0007。其中YT、DY與CH等種群的Hd和π較高，其他種群的較低，尤其是HS與LA等種群的最低。以上結(jié)果顯示出，依賴于線粒體控制區(qū)，長(zhǎng)江流域及淮河流域分布的沙塘鱧屬魚類遺傳多樣性較低，且中華沙

10、塘鱧的遺傳多樣性較河川沙塘鱧的高。
　　(3)遺傳分化與種群遺傳結(jié)構(gòu)分析。中華沙塘鱧與河川沙塘鱧的種群間遺傳分化指數(shù)（FST）依次為0.4822與0.9023，處于較高水平遺傳差異（FST>0.25）；AMOVA分析結(jié)果顯示兩物種具有顯著的遺傳結(jié)構(gòu)；種群間NJ分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系揭示：17個(gè)沙塘鱧種群顯著的分為兩大支，即中華沙塘鱧的5個(gè)種群（YT、YD、HH、DY、JZ）22個(gè)單倍型聚為一支（Cluster1），河川沙塘鱧的12個(gè)種群

11、12個(gè)單倍型序列聚為另一大支，而且也可以看出河川沙塘鱧12個(gè)種群可以細(xì)分為兩個(gè)大的聚類支，分別為分布于長(zhǎng)江中游的LA、CH、XC和HS4種群聚為一支（Cluster3），分布于長(zhǎng)江下游及淮河下游的8個(gè)種群4個(gè)單倍型序列聚為一支（Cluster2），且3個(gè)聚類分支呈現(xiàn)出按不同地理區(qū)域分別聚類的現(xiàn)象，單倍型最小跨度網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖結(jié)果與其一致。
　　(4)種群歷史動(dòng)態(tài)。中性檢測(cè)和錯(cuò)配分析均揭示，中華沙塘鱧種群都曾發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張事件；河川沙塘

12、鱧種群除GY、SZ、HZT和CH等4種群外都沒(méi)有發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張事件。按聚類關(guān)系來(lái)看，Cluster1與Cluster2聚類群經(jīng)歷了歷史種群擴(kuò)張事件，Cluster3未發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張事件。若以線粒體D-loop基因每百萬(wàn)年3%～12%的進(jìn)化速率，估計(jì)得到的中華沙塘鱧與河川沙塘鱧種群擴(kuò)張時(shí)間分別為0.0237~0.0946Myr與0.0048~0.0193Myr前，均約為第四紀(jì)更新世晚期。中華沙塘鱧的分化時(shí)間較早。
　　3.基于核基因

13、EPICs分子標(biāo)記的沙塘鱧屬魚類的種群遺傳多樣性及分子生物地理學(xué)研究EPICs(Exon-primed intron-crossing markers)，是一種匿名核基因標(biāo)記的研究，原理是在匿名外顯子區(qū)設(shè)計(jì)引物對(duì)中間內(nèi)含子進(jìn)行擴(kuò)增，使得該標(biāo)記既具有外顯子的保守特性，又具有內(nèi)含子進(jìn)化速率快的特點(diǎn)。EPICs內(nèi)含子標(biāo)記因外顯子較內(nèi)含子更保守并且有大量匿名基因，已成功的運(yùn)用于物種水平和更廣泛的生物分類單元研究中。
　　本實(shí)驗(yàn)克隆選取55

14、378E1、55305E1和36298E1全序列，分別長(zhǎng)1300bp、1600bp與2100bp，分析時(shí)去除兩端測(cè)序錯(cuò)誤和比對(duì)缺失區(qū)（missing data），并進(jìn)行顯著性PHI檢測(cè)去除重組序列52bp，然后拼接為3733bp進(jìn)一步對(duì)上述17個(gè)沙塘鱧屬魚類種群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如下：
　?。?）序列分析。中華沙塘鱧種群有279個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（7.47%），44條堿基序列可定義44個(gè)單倍型（haplotypes）；河川沙塘鱧有34

15、3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（9.19%），119條堿基序列可定義115個(gè)單倍型。
　?。?）遺傳多樣性分析。中華沙塘鱧種群的單倍型多樣性（Hd）與核苷酸多樣性（π）為1.0000和0.0118，核苷酸多樣性變化范圍為0.0034~0.0121；而河川沙塘鱧的Hd與π為0.9994和0.0039，Hd與π變化范圍在0.9167~1.0000和0.0007~0.0037之間。顯示出不論是中華沙塘鱧還是河川沙塘鱧，都是單倍型多樣性高、核苷酸多樣性低，

16、且中華沙塘鱧遺傳多樣性高于河川沙塘鱧的遺傳多樣性。
　?。?）種群NJ聚類分析。中華沙塘鱧5個(gè)種群間遺傳距離變化范圍為0.0086~0.0149；河川沙塘鱧12個(gè)種群間的遺傳距離變化范圍為0.0026~0.0067。NJ單倍型種群遺傳距離分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示：17個(gè)沙塘鱧種群顯著的分為兩大支，即中華沙塘鱧的5個(gè)種群44個(gè)單倍型聚為一支（Cluster1），河川沙塘鱧的12個(gè)種群115個(gè)單倍型序列可以聚為另外一大支（Cluster3

17、），且2個(gè)大的聚類分支明顯呈現(xiàn)出按不同地理區(qū)域分別聚類的現(xiàn)象，即Cluster1組群分布于長(zhǎng)江中上游，Cluster3組群分布于長(zhǎng)江中下游開(kāi)闊的沖積平原。另外也可以看出，Cluster2組群是從Cluster3組群中細(xì)分出來(lái)的，Cluster2組群分布于淮河上游與長(zhǎng)江中游的安徽巢湖、宣城以及黃山等地。Cluster2與Cluster3內(nèi)部個(gè)體單倍型基因序列也出現(xiàn)了較少的不同地理區(qū)域交叉聚類的現(xiàn)象。
　?。?）種群遺傳結(jié)構(gòu)分析。17

18、個(gè)種群間FST均較高（0.7325~0.7709）。AMOVA顯示出17個(gè)種群被分為3組時(shí)遺傳分化指數(shù)最高，且種群間的變異（0.7709）大于種群內(nèi)個(gè)體間的變異（0.1992）（P<0.01），說(shuō)明沙塘鱧屬魚類種群的遺傳差異主要表現(xiàn)在種群間。單倍型最小跨度網(wǎng)絡(luò)關(guān)系顯示出：中華沙塘鱧與河川沙塘鱧經(jīng)過(guò)了117次的變異才區(qū)分開(kāi)來(lái)。
　?。?）中性檢驗(yàn)分析與核苷酸錯(cuò)配分布分析，Cluster1、Cluster2與Cluster3的Taji

19、ma’s D依次為-1.2913（P>0.05）、-2.0365（P<0.05）和-2.6175（P<0.01），F(xiàn)u’s FS值依次為-17.0490（P>0.05）、-23.1810（P<0.01）與-92.8640（P<0.01），Rg與R2全大于零（P>0.05），這些都顯示出這三大聚類群經(jīng)歷了歷史種群擴(kuò)張事件。
　?。?）中華沙塘鱧與河川沙塘鱧的分界地理屏障可能是長(zhǎng)江中游安徽境內(nèi)的皖南山區(qū)（大別山和黃山）?！熬嚯x-隔離”

20、模型檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Cluster2種群間的地理距離(直線距離)和遺傳距離[F’st/(1-F’st]的正相關(guān)性為Y(x)=0.0027*x+0.4104，分布斜率較小，Cluster2種群間內(nèi)部遺傳距離較小，分布較集中；相較而言，Cluster3種群間的地理距離和遺傳距離的正相關(guān)性為Y(x)=0.0071*x+0.9465，分布斜率較大，Cluster3種群間內(nèi)部遺傳距離[F’st/(1-F’st]分布較廣泛。
　　（7）沙塘鱧屬

21、魚類的系統(tǒng)地理格局應(yīng)該屬于Avise系統(tǒng)地理格局中的第三或第五種：即不同種群系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系連續(xù)，所屬地理分布不同或部分連續(xù)，部分種群發(fā)生過(guò)種群替代現(xiàn)象，替代時(shí)間較短，尤其分布于長(zhǎng)江中下游的河川沙塘鱧呈現(xiàn)出中度水平的基因交流，僅部分基因型具有廣泛的地理分布格局，即共享單倍型種類較少。
　　4.基于微衛(wèi)星標(biāo)記的沙塘鱧屬魚類種群遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)分析
　?。?）利用生物素標(biāo)記-磁珠富集法開(kāi)發(fā)中華沙塘鱧與河川沙塘鱧的微衛(wèi)星分子標(biāo)

22、記，分別篩選出了13對(duì)和14對(duì)微衛(wèi)星引物，依次用湖北荊州種群（JZ）和江蘇蘇州太湖種群（SZ）27尾個(gè)體與45尾個(gè)體進(jìn)行分子標(biāo)記多態(tài)性檢測(cè)。
　　結(jié)果為：中華沙塘鱧，等位基因數(shù)目NA、多態(tài)信息含量PIC、觀測(cè)雜合度HO和期望雜合度HE分別為6~21(平均14.2778)、0.7447~0.9303(平均0.8816)、0.3333~1.0000(平均0.5412)和0.7764~0.9518(平均0.8812)。有3個(gè)位點(diǎn)(O.s

23、in7，O.sin13和O.sin17)顯著偏離哈溫平衡（HWE）(*P<0.05)，經(jīng)Bonferroni矯正，13個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)間未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡；河川沙塘鱧，等位基因數(shù)目NA、多態(tài)信息含量PIC、觀測(cè)雜合度HO和期望雜合度HE依次為8~30(平均20.9286)、0.8020~0.9354(平均0.8962)、0.7500~1.0000(平均0.9508)和0.8436~0.9628(平均0.9101)，6個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)(O.p

24、ot1，O.pot2，O.pot4，O.pot5，O.pot10 and O.pot14)偏離哈溫平衡(*P<0.05)，經(jīng) Bonferroni矯正，14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)間未發(fā)現(xiàn)連鎖不平衡。本研究開(kāi)發(fā)的兩種魚27對(duì)SSR引物的PIC值均較高，這對(duì)于進(jìn)一步研究沙塘鱧屬魚類的遺傳多樣性與種群遺傳結(jié)構(gòu)意義重大，因?yàn)?，更高的PIC值（PIC>0.5）相對(duì)而言能夠提供更加豐富的遺傳信息。
　?。?）對(duì)篩選的27對(duì)引物進(jìn)行跨種擴(kuò)增(Cross-

25、species amplification)，得到可以同時(shí)穩(wěn)定擴(kuò)增兩種沙塘鱧的適用性引物10對(duì)。應(yīng)用于長(zhǎng)江流域和淮河流域沙塘鱧屬魚類種群的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析。
　　結(jié)果為：
　　①遺傳多樣性分析，其中中華沙塘鱧與河川沙塘鱧平均等位基因數(shù)NA、平均等位基因豐富度AR、平均期望雜合度和觀測(cè)雜合度（HE和HO）、平均多態(tài)信息含量PIC依次為10.6000與10.8333、8.2728與8.0890、0.9678與0.9600

26、、0.9240與0.9143、0.8559與0.8546。各種群之間近交系數(shù)FIS變化范圍為-0.0820~0.0690，平均近交系數(shù)為-0.0595，顯示沙塘鱧種群偏向于隨機(jī)交配。以上各指標(biāo)均表明，長(zhǎng)江流域沙塘鱧屬魚類野生種群的遺傳多樣性較豐富，且中華沙塘鱧種群的遺傳多樣性較河川沙塘鱧的稍高。
　?、诜N群的遺傳結(jié)構(gòu)和聚類分析，對(duì)于中華沙塘鱧和河川沙塘鱧而言，不同種群間的遺傳距離變化范圍分別為-0.0179~0.0413和0.00

27、38~0.0943。AMOVA分析顯示：組群間的遺傳差異最小，組群內(nèi)種群間的遺傳差異最大。STRUCTURE聚類分析發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江流域及淮河流域的沙塘鱧屬魚類種群最佳分群為3組，Cluster1為YD種群、DY種群、JZ種群、HH種群與YT種群；Cluster2為L(zhǎng)A種群、CH種群、XC種群與HS種群；Cluster3為HA種群、YZ種群、GY種群、JJ種群、SZ種群、HZJ種群、HZT種群與SH種群。主坐標(biāo)分析（Principal coo