靶向性p53融合蛋白的制備、檢測(cè)與功能分析.pdf

1、生物藥物是一類采用現(xiàn)代生物技術(shù)而得到的用于預(yù)防、治療和診斷的藥物。因其具有藥理活性高、毒副作用小、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、治療針對(duì)性強(qiáng)的特點(diǎn)而成為21世紀(jì)最有發(fā)展?jié)摿Φ男屡d藥物。因此國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域高度重視生物藥物的研發(fā)和制備，而對(duì)其分析鑒定和檢測(cè)則是將其推廣至臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)。
　　p53基因是一個(gè)重要的抑癌基因，它編碼的p53蛋白在識(shí)別和修復(fù)DNA損傷、抑制細(xì)胞惡性增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯方面發(fā)揮重要作用。野生型p53基因的缺失

2、會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，然后細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)、凋亡和DNA修復(fù)功能的紊亂。據(jù)報(bào)道稱，25％-35％的癌性神經(jīng)細(xì)胞和70％-76％的膠質(zhì)瘤細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)p53基因的突變，所以恢復(fù)細(xì)胞中的p53蛋白功能被認(rèn)為是神經(jīng)腫瘤治療的一種方法。由于p53蛋白的制備、檢測(cè)及功能分析是其用于腫瘤治療的基礎(chǔ)，常規(guī)的檢測(cè)方法如ELISA、Western blot等只能對(duì)p53蛋白進(jìn)行定性和定量分析，不能保證其生物活性，因此需要既能保證蛋白準(zhǔn)確性又能檢測(cè)其功能的方法來(lái)分析檢

3、測(cè)p53。
　　p53蛋白細(xì)胞滲透性較低，僅靠自身難以穿過細(xì)胞膜進(jìn)入神經(jīng)腫瘤細(xì)胞，這使得p53蛋白的應(yīng)用受到了一定限制。因此可考慮p53蛋白與具有穿膜效應(yīng)的多肽結(jié)合來(lái)提高p53蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。實(shí)驗(yàn)組前期發(fā)現(xiàn)一個(gè)新型衍生肽，命名為RDP（RVG-derived peptides），它的部分序列來(lái)源于狂犬病毒糖蛋白(RVG)嗜神經(jīng)性的關(guān)鍵片段。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能攜帶BDNF蛋白及基因快速特異性地進(jìn)入腦內(nèi)并發(fā)揮功能，因此考慮將RDP與p53蛋

4、白通過化學(xué)鍵連接，確定其分析方法并檢測(cè)p53蛋白在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能，從而希望為抑制神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，如惡性腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)增殖提供一種新的方法。
　　第一部分:利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-p53，將p53基因連接到pET28a中。優(yōu)化了p53蛋白的制備條件，SDS-PAGE分析了p53蛋白的準(zhǔn)確性，F(xiàn)olin-酚法對(duì)p53蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，然后分別制備并純化了靶向性p53融合蛋白和p53蛋白。
　　第二部分:分別

5、合成了熒光染料FITC和羅丹明B異硫氰酸酯(Rho B)標(biāo)記的靶向性p53融合蛋白和p53蛋白，并采用熒光分光光度法分析了該蛋白的熒光強(qiáng)度，然后通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小動(dòng)物活體成像分析檢測(cè)了靶向性p53蛋白的細(xì)胞選擇性和入腦可行性。
　　第三部分:對(duì)靶向性p53融合蛋白的功能進(jìn)行分析。通過MTT法檢測(cè)靶向性p53融合蛋白的生物活性，并采用凋亡與壞死檢測(cè)、流式細(xì)胞儀來(lái)探究靶向性p53融合蛋白的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明靶向性p53融合蛋白不僅對(duì)