G蛋白偶聯(lián)受體激酶5與p53的相互作用及其對p53功能影響的研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)是體內(nèi)最大的一個(gè)膜受體超家族,能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)多種胞外信號如光線,嗅覺,激素,神經(jīng)遞質(zhì),藥物等物理和化學(xué)信號。通過偶聯(lián)不同的G蛋白,G蛋白偶聯(lián)受體可以激活不同的下游效應(yīng)分子,從而發(fā)揮重要的生理功能,如細(xì)胞的增殖,趨化,凋亡等。由于其功能復(fù)雜,GRKCR在體內(nèi)收到了嚴(yán)格的調(diào)控,其中最重要的一種方式就是G蛋白偶聯(lián)受體激酶(GRKs)對它的磷酸化。GRKs家族目前一共有7個(gè)成員,除了GRK1、7和4,其他的GRK成員在體內(nèi)廣

2、泛分布,因此關(guān)于GRK功能的研究越來越受到人們重視。目前的研究發(fā)現(xiàn),除了經(jīng)典的磷酸化GPCR外,GRKs還具有其它的功能:如在與激素有關(guān)的腫瘤中發(fā)現(xiàn)GRKs的表達(dá)出現(xiàn)了異常,用GRK2抑制劑處理前列腺癌細(xì)胞可使癌細(xì)胞的生長速度下降等。這些都提示GRKs在細(xì)胞增殖方面可能有一定的影響。
　　腫瘤抑制因子p53是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)非常重要的調(diào)節(jié)蛋白,在維持體細(xì)胞的遺傳一致性方面起著舉足輕重的作用。它的功能主要包括細(xì)胞周期的阻滯,誘發(fā)凋亡,抑制

3、腫瘤生長等。正常情況下體內(nèi)p53的水平很低,但是在細(xì)胞受到刺激如DNA損傷,原癌基因不正常激活,缺氧等情況時(shí),p53的蛋白水平和活性會都升高。體內(nèi)p53受到多方面的調(diào)控,其中最重要的是對它的轉(zhuǎn)錄后修飾,包括絲/蘇氨酸的磷酸化,乙酰化,泛素化等。其中,p53的磷酸化在調(diào)節(jié)它的蛋白水平方面起著非常重要的作用。由于可以磷酸化的位點(diǎn)較多,p53的磷酸化模式呈現(xiàn)出多態(tài)性:同一種激酶可以磷酸化不同的位點(diǎn),不同的激酶可以磷酸化同一個(gè)位點(diǎn);可以是某一個(gè)

4、位點(diǎn)的磷酸化或者是多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)被磷酸化。P53的磷酸化在調(diào)節(jié)它的蛋白水平方面起著重要作用。
　　目前研究發(fā)現(xiàn)的能夠調(diào)控p53的蛋白很多,這些蛋白或結(jié)合于p53的C末端,調(diào)節(jié)它與目的基因的結(jié)合能力,或結(jié)合于它的N某端,調(diào)節(jié)它的轉(zhuǎn)錄活性以及泛素化降解。在本研究中:
　　(1)通過免疫共沉淀,GST-pulldown等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),我們首次證明了GRK5與p53間存在直接的相互作用。
　　(2)通過對兩者之間結(jié)合位點(diǎn)的研究發(fā)

5、現(xiàn),GRK5結(jié)合于p53的N末端和它的中間部分,也就是它的序列特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(sequence specific DNA-binding domain,DBD),且與DBD的結(jié)合是最強(qiáng)的,而與它的C末端不結(jié)合,說明GRK5與p53的結(jié)合可能是通過多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行的,主要的結(jié)合位點(diǎn)位于p53的DBD區(qū)域。
　　(3)為了研究GRK5對p53功能的影響,我們進(jìn)行了細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明GRK5能夠抑制p53對于細(xì)胞增殖的抑制作用,

6、促進(jìn)細(xì)胞的生長。這種作用是p53依賴的,也依賴于GRK5的激酶活性。說明GRK5可以抑制p53的功能。
　　我們的研究通過體內(nèi)和體外的結(jié)合實(shí)驗(yàn)首次證明了GRK5能夠與p53直接結(jié)合,這種結(jié)合不依賴于GRK5的激酶活性,并且通過兩者之間結(jié)合位點(diǎn)的研究證明GRK5與p53間的結(jié)合是多位點(diǎn)的結(jié)合。之后我們又進(jìn)一步證明了這種相互作用能夠抑制p53的功能。這些都提示,除了經(jīng)典的磷酸化GPCR來發(fā)揮作用,GRKs還能夠直接調(diào)節(jié)其他非GPCR蛋