基于納米材料為基質(zhì)固定生物分子的免疫傳感器研究.pdf

1、乙腦是由乙腦病毒引起、經(jīng)蚊傳播的人畜共患的中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染病。患者愈后不好，或者因呼吸衰竭而死亡；而先天性風(fēng)疹綜合癥是胎兒時(shí)期就感染風(fēng)疹病毒，該病毒可導(dǎo)致胎兒出生后高血壓、先天性心臟病、腦炎、智力障礙等，嚴(yán)重危害人類。接種流行性乙型腦炎疫苗或風(fēng)疹疫苗是人類預(yù)防這兩種傳染性疾病的強(qiáng)有力武器，而此兩種疫苗的效價(jià)直接影響接種效果。目前，檢測乙腦、風(fēng)疹疫苗的方法主要有細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量法、血凝抑制試驗(yàn)、動(dòng)物法、蝕斑減少中和試驗(yàn)法、酶聯(lián)免疫吸附

2、試驗(yàn)等。前幾種操作繁瑣、靈敏度度低、周期長、費(fèi)用高、對操作者要求高，結(jié)果有一定的主觀性，一般實(shí)驗(yàn)室難以操作。而后者也存在操作繁瑣、特殊酶標(biāo)記物不易獲得、費(fèi)用高等問題，因此急需尋求一種快速準(zhǔn)確檢測流行性乙腦疫苗和風(fēng)癥疫苗效價(jià)的方法。 以免疫分析技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的免疫傳感器，由于其技術(shù)具有分析靈敏度高、特異性強(qiáng)、使用簡便及成本低等特點(diǎn)大大地推動(dòng)了免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)、臨床、生物、化學(xué)、環(huán)境、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等方面的應(yīng)用和發(fā)展。在各種免疫傳

3、感器研究中，酶標(biāo)記電流型免疫傳感器因其具有高度的特異性和極低的檢出限而引起人們的興趣。酶標(biāo)記電流型免疫傳感器的原理主要有競爭法和夾心法，通過檢測標(biāo)記物的量變監(jiān)控免疫分析反應(yīng)，該種類型的傳感器非特異性響應(yīng)小，但檢測過程較復(fù)雜、特殊酶標(biāo)記物不易獲得、費(fèi)用高等問題，因此尋求具有靈敏度高、快速、成本低、攜帶方便，操作簡單、易數(shù)字化、能方便地實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)輸出和檢測的無酶標(biāo)記電流型免疫傳感器具有重要意義。 以沉積在電極上的普魯士藍(lán)為氧化還原探針

4、，利用電聚合技術(shù)及氨基與納米材料強(qiáng)靜電結(jié)合作用，將納米材料層層組裝在普魯士藍(lán)修飾電極上，利用其具有強(qiáng)吸附效應(yīng)的特點(diǎn)將抗體固定在電極上，然后用牛血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn)，最后以電極響應(yīng)電流與抗原濃度成反比的特性，制備了無酶標(biāo)記的電流型免疫傳感器；或以酶取代牛血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn)，在固定過氧化氫濃度的條件下，直接測定抗原與抗體反應(yīng)前后的電流變化，從而制備了酶封閉非特異性位點(diǎn)的無酶標(biāo)記電流型免疫傳感器：或利用自組裝、電聚合等技術(shù)，制備

5、了多層組裝的電位型免疫傳感器。上述傳感器利用納米材料大的比表面積及良好的生物兼容性，增大了固定在電極上的抗體量，并使抗體保持良好的生物活性，從而提高了傳感器的靈敏度。此外，利用碳納米管能促進(jìn)酶直接電子轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)及復(fù)合納米材料具有吸附定向效應(yīng)、吸附濃縮效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，其比單獨(dú)一種納米顆粒更易于形成連續(xù)勢場，從而降低電子在電極和固定化載體之間的遷移阻力，提高電子遷移率等優(yōu)點(diǎn)，初步制得第三代電流型免疫傳感器。 上述免疫傳感器操作簡

6、單、靈敏度高、快速，可望作為一種生物制品效價(jià)檢測的工具。 本文第一部分詳細(xì)研究了無酶標(biāo)記電流型免疫傳感器的研究 1．改變以往報(bào)道的電流型免疫傳感器以酶標(biāo)記，檢測步驟復(fù)雜的缺點(diǎn)，將氧化還原性很強(qiáng)的媒介體沉積在電極上，然后利用電聚合和層層組裝技術(shù)組裝納米金，并以納米材料特殊的表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和良好的生物相容性等性質(zhì)固定了足量的抗體，并可使抗體保持良好的生物活性，且因?yàn)榧{米顆粒具有吸附濃縮效應(yīng)，可以顯著提高電極的電流響應(yīng)

7、的特點(diǎn)，制備了基于雙層納米金／聚鄰苯二胺固定乙腦抗體并以普魯士藍(lán)為電子媒介體，再以牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的無標(biāo)記電流乙腦疫苗免疫傳感器。本章討論了該傳感器制備時(shí)納米金／聚鄰苯二胺層數(shù)、干擾等的影響，優(yōu)化了反應(yīng)時(shí)間、pH、反應(yīng)溫度等。該傳感器的線性范圍1.1×10<'-8>-1.9×10<'6>lg pfu/mL（蝕斑單位）。 2．詳細(xì)研究了基于雙層納米銀／聚鄰苯二胺固定抗體以普魯士藍(lán)為電子媒介體，并以牛血清白蛋

8、白封閉電極上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)的無標(biāo)記風(fēng)疹疫苗免疫傳感器。通過循環(huán)伏安法技術(shù)考察了電極表面的電化學(xué)特性，并對該免疫傳感器的性能進(jìn)行了詳細(xì)的研究。與傳統(tǒng)風(fēng)疹疫苗效價(jià)檢測方法的操作繁瑣、靈敏度度低、周期長、費(fèi)用高、對操作者要求高等缺點(diǎn)相比，該免疫傳感器具有靈敏度高、線性范圍寬、響應(yīng)時(shí)間快、，穩(wěn)定性好、可重復(fù)使用、選擇性高等特點(diǎn)。 3．首次提出以辣根過氧化氫酶取代牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，制備了雙層納米銀／聚鄰苯二胺固

9、定風(fēng)疹抗體并以普魯士藍(lán)為電子媒介體的高靈敏風(fēng)疹疫苗免疫傳感器。該論文的特點(diǎn)是以辣根過氧化氫酶取代牛血清白蛋白封閉電極上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，達(dá)到封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)的目的，又有放大電信號的功能，既是把電極上的位點(diǎn)充分利用起來，制得的高靈敏免疫傳感器。 本文第二部分詳細(xì)研究了無電子媒介體的電流型免疫傳感器的研究 利用碳納米管能促進(jìn)酶直接電子轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)及復(fù)合納米材料具有吸附定向效應(yīng)、吸附濃縮效應(yīng)和量子尺寸效應(yīng)，從而比單獨(dú)一種納

10、米顆粒更易于形成連續(xù)勢場，降低電子在電極和固定化載體之間的遷移阻力，提高電子遷移率等優(yōu)點(diǎn)，研究了以辣根過氧化氫酶封閉電極非特異性結(jié)合位點(diǎn)而制備的辣根過氧化物酶／抗體／納米金／多壁納米碳管修飾電極，其中利用多壁納米碳管的電化學(xué)特性及其對辣根過氧化物酶的直接電化學(xué)形為及共同對H<,2>O<,2>的電催化，放大了電信號，提高電極的靈敏度及穩(wěn)定性，從而初步制備制得第三代電流型免疫傳感器。 本文第三部分詳細(xì)研究了第三代酶傳感器的研究

11、 以固定在玻碳電極上的多壁納米碳管為基底吸附辣根過氧化物酶，然后固定納米金，最后再結(jié)合一層辣根過氧化物酶，利用多壁納米碳管對辣根過氧化物酶的直接電化學(xué)催化特性及納米金對蛋白質(zhì)的強(qiáng)吸附能力及強(qiáng)的電子傳導(dǎo)特性制備了第三代電流型酶傳感器。采用循環(huán)伏安法，在無電子媒介體時(shí)，該傳感器對H<,2>O<,2>仍能具有良好的催化活性，放大了電信號，提高了該酶傳感器的靈敏度；此外，不存在電子媒介體的滲漏與富積等問題，提高了電極的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)證明該傳感器

12、在H<,2>O<,2>濃度為1.0×10<'-6>-1.0×10<'-3>mol／L范圍內(nèi)有線性響應(yīng)，線性相關(guān)系數(shù)R<'2>=0.9964，并探討了電極的穩(wěn)定性、壽命及重現(xiàn)性。 本文第四部分詳細(xì)研究了電位型免疫傳感器的研究 1．嘗試以層層自組裝技術(shù)制備空間有序，納米顆粒增大了固定的抗體量，且被納米顆粒吸附的抗體不易在測試溶液中流失，增加了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而可提高檢測靈敏度的原理，研制了基于nano-Au增強(qiáng)多層自組裝的

13、電位型免疫傳感器。該傳感器采用自組裝和靜電吸附技術(shù)，先在電極上修飾一層薄膜，然后通過正負(fù)電荷靜電吸附等技術(shù)將納米材料固定在電極上，構(gòu)造了三明治nano-Au／Co（bpy）<,3><'3+>電極，并以nano-Au固定抗體的電位型乙腦疫苗免疫傳感器。文中討論了nano-Au粒子的優(yōu)化，離子強(qiáng)度、pH的優(yōu)化、回收率、重線性等。該傳感器的線性范圍8.1×10<'-8>-3.0×10<'-6>lg pfu／mL。E=55.922log［C］+