漢族兒童NKG2-C基因缺失及體外Hpa、氯酸鈉聯合作用與HCMV感染的相關性研究.pdf

1、第一部分：
　　 漢族兒童NKG2-C基因缺失與巨細胞病毒感染相關性研究
　　 目的：本實驗通過收集兒童血標本，用不同的檢測方法檢測外周血基因組中有無NKG2-C基因片段的缺失。確定兒童中NKG2-C基因片段的缺失率，并確定在臨床上有感染人巨細胞病毒(humancytomegalovirus，HCMV)明顯癥狀的患兒，他們是否存在NKG2-C缺失。為以后巨細胞病毒的診斷與治療尋找新的方法提供理論基礎。
　　 方法

2、：在江蘇大學附屬人民醫(yī)院收集104份患兒血液標本，將其分為巨細胞病毒感染組(HCMV+)與非巨細胞病毒感染組(HCMV-)。提取基因組DNA、設計引物、做普通PCR得到NKG2-C的基因片段。用所獲得的基因片段樣本做瓊脂糖凝膠電泳，通過紫外檢測儀曝光檢測有無相應基因長度的條帶顯示在瓊脂糖膠上。篩選出缺失樣本與帶有NKG2-C基因的基因組樣本作為對照為一組，已做過普通PCR后的NKG2-C基因片段樣本為一組，兩組都送基因測序公司測序。

3、r>　　 結果：在HCMVˉ組中患兒中NKG2-C純合子缺失大約有4.16％。根據Hardy-Weinberg假設原理，計算出等位基因缺失概率約20.4％。在HCMV+中患兒NKG2-C純合子缺失大約有50％。兩組相比，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，采用卡方檢驗中Yates校正公式計算出x2＝15.9，x2＞x20.05，P＜0.005，得出兩組NKG2-C基因片段的缺失相比差異是有明顯統(tǒng)計學意義的結論。
　　 結論：實驗研究

4、結果表明容易感染HCMV的兒童可能與其NKG2-C的缺失有關。本實驗研究為以后巨細胞病毒的診斷與治療都提供了理論依據。
　　 第二部分：
　　 肝素酶聯合氯酸鈉體外抗人巨細胞病毒的作用
　　 目的：研究在體外用肝素酶與氯酸鈉干預人胚肺成纖維細胞（Humanembryoniclungfibroblast，HELF），觀察人巨細胞病毒感染干預HELF后的細胞病變，為證明細胞表面的硫酸乙酰肝素(heparansulfa

5、te，HS)與HCMV感染人胚胎成纖維細胞的吸附過程的關系。
　　 方法：1.測定HCMVAD169對HELF的毒力已長成單層HELF細胞培養(yǎng)板中加入10-1-10-7的HCMV病毒懸液，設正常細胞組為對照組，各組設8個復孔。當觀察到細胞特征性病變效應(CPE)不再有變化時，記錄出現CPE的孔數，按照Reed-Muench法計算半數組織培養(yǎng)感染量(TCID50)。
　　 2.測定氯酸鈉對HELF的毒性將不同濃度的氯酸鈉分

6、別加入已長成單層HELF細胞培養(yǎng)板中，設5個復孔，同時設不加氯酸鈉的HELF為對照組。當倒置顯微鏡下觀察到的細胞病變不再有變化約7天時，用MTT比色法測定每孔的4490值。計算細胞存活率(CSR)、半數中毒濃度(TD50)，推算出最大無毒濃度(TD0)。
　　 3.分組并進行熒光定量-PCR檢測根據不同的干預方法分為:細胞組(A)、病毒組(B)、氯酸鈉組(C)、肝素酶組(D)、聯合用藥組(E)。提取各組細胞內HCMVDNA，然后

7、對其DNA提取液進行熒光定量-PCR檢測。
　　 結果：
　　 1.本實驗測得的HCMV對HELF細胞半數感染量(TCID50)=10-4.4/0.1mL。
　　 2.氯酸鈉的最大無毒濃度(TD0)為40Mmol/L。
　　 3.B-E組HCMVDNA載量的均值分別為2.0735×106copies/50mg、6.4140×105copies/50mg、6.104×105copies/50mg、1.737