HCMV體外感染鼠胚成纖維細(xì)胞與感染復(fù)數(shù)相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)在體外可以增殖性感染鼠胚成纖維細(xì)胞(mouse embryo fibroblast，MF)，探討HCMV體外增殖性感染MF細(xì)胞與感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)的相關(guān)性，為HCMV跨種屬感染的分子機(jī)制研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：HCMV AD169毒株復(fù)蘇感染人胚成纖維細(xì)胞(human embryo fibrobla

2、st，HF)，連續(xù)傳代三次，待細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)達(dá)“4+”時(shí)，反復(fù)吹打使病毒釋放，4℃ 3 000 rpm離心10 min，收獲上清：部分上清作PFU試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度，其余凍存于-80℃冰箱；設(shè)定MOI為0.1、1、10和100，根據(jù)測(cè)定出的病毒滴度和細(xì)胞計(jì)數(shù)，算出各MOI所需病毒量，分別接種至6孔培養(yǎng)板對(duì)應(yīng)的MF細(xì)胞和HF細(xì)胞上，置5％CO<,2>溫箱37℃培養(yǎng)，次日換維持液，逐日鏡下觀察HCM

3、V特征性CPE；分別在第1、2、5、7、10和14 d收集細(xì)胞和培養(yǎng)物上清，進(jìn)行下列各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)：(1)培養(yǎng)物上清采用PFU試驗(yàn)檢測(cè)其中的病毒滴度；(2)收集的細(xì)胞用于進(jìn)行RT-PCR半定量檢測(cè)HCMV IE和UL83基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平；(3)第14 d后的細(xì)胞培養(yǎng)物用于抽提DNA基因組，行PCR檢測(cè)HCMV UL83基因驗(yàn)證病毒；(4)采用透射電鏡觀察不同MOI感染的MF和HF細(xì)胞內(nèi)有無(wú)皰疹病毒樣病毒顆粒形態(tài)特征，在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位

4、以及感染的MF和HF細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化與MOI的關(guān)系。 結(jié)果：以MOI為0.1和1感染MF和HF細(xì)胞時(shí)，MF細(xì)胞在2周的培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有觀察到CPE的產(chǎn)生，HF細(xì)胞分別在第10 d和第7 d出現(xiàn)了較為明顯的特征性CPE，光鏡下觀察可見(jiàn)部分細(xì)胞腫脹、變圓、折光性增強(qiáng)等特征；以MOI為10和100感染：MF和HF細(xì)胞時(shí)，MF細(xì)胞分別在第7 d和第5 d出現(xiàn)了明顯的特征性CPE，HF細(xì)胞分別在第5 d和第3 d出現(xiàn)了明顯的特征性CPE，光

5、鏡下所見(jiàn)同前。 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞病變明顯加重，顆粒狀物越來(lái)越多，CPE擴(kuò)展至整個(gè)單層細(xì)胞。MOI為0.1和1感染MF細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)物上清經(jīng)PFU試驗(yàn)測(cè)定，均在第1和2 d的取樣中檢測(cè)到病毒的滴度很低，其他5個(gè)時(shí)間點(diǎn)未檢測(cè)到空斑形成。MOI為10和100感染MF細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)的培養(yǎng)物PFU測(cè)定結(jié)果顯示：MOI為100時(shí)感染MF細(xì)胞，第1 d培養(yǎng)物上清中病毒滴度為5.8×10<'1>PFUs/ml，第2 d病毒滴度增高到1

6、.5×10<'2> PFUs/ml，在感染的第5 d病毒度的滴度高達(dá)2.1×10<'5>PFUs/ml，等到感染的第10 d時(shí)，病毒的滴度達(dá)到了高峰，為1.2×10<'7>PFUs/ml，接下來(lái)隨著病變細(xì)胞的死亡病毒滴度開(kāi)始下降，到第14 d病變細(xì)胞完全脫落死亡時(shí)，病毒滴度降為3.4×10<'5>PFUs/ml，這與在鏡下觀察到出現(xiàn)特征性CPE的時(shí)間基本一致。MOI為10時(shí)病毒滴度的變化趨勢(shì)和MOI為100時(shí)基本一致，但MOI為10時(shí)，

7、在第14 d時(shí)MF病變細(xì)胞并沒(méi)有完全死亡脫落。而與MF平行設(shè)置的HF細(xì)胞對(duì)照中，四個(gè)MOI中PFU試驗(yàn)均可檢測(cè)到空斑的形成且病毒滴度隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，直到病變細(xì)胞死亡后病毒滴定開(kāi)始下降；MOI為10和100時(shí)，病毒滴度的遞增趨勢(shì)與HF平行對(duì)照中檢測(cè)的結(jié)果相類似。本研究中，對(duì)四個(gè)MOI第14 d后的培養(yǎng)物用PCR進(jìn)行了驗(yàn)證，MOI為0.1，1，10和100時(shí)均可在766bp處擴(kuò)增出HCMV UL83基因的特異性條帶。RT-PCR半定量

8、檢測(cè)結(jié)果顯示：MOI為0.1和1時(shí)，未檢測(cè)到HCMV IE和UL83 mRNA的轉(zhuǎn)錄；而MOI為10和100時(shí)均檢測(cè)到了HCMV IE和UL83 mRNA的轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄水平隨著時(shí)間的推移呈遞增趨勢(shì)，直逐漸達(dá)高峰，隨后呈下降趨勢(shì)。透射電鏡觀察結(jié)果：在MOI為0.1和1時(shí)，電鏡觀察MF細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外未見(jiàn)皰疹樣病毒顆粒；而MOI為10和100時(shí)，在透射電鏡下可見(jiàn)MF細(xì)胞內(nèi)有皰疹樣病毒顆粒存在。 結(jié)論：(1)本研究通過(guò)PFU試驗(yàn)準(zhǔn)確測(cè)定感