大麥耐鎘及鎘積累相關(guān)QTL定位與候選基因篩選及調(diào)控研究.pdf

1、鎘是一種有毒重金屬，其在環(huán)境中的遷移性強，極易被植物吸收積累，并通過食物鏈危害人體健康。明確大麥耐鎘與鎘積累機理是培育耐鎘與低鎘積累新品種和制訂耐鎘與低鎘積累調(diào)控措施的基礎(chǔ)。本研究以本實驗室前期篩選獲得的鎘耐性與鎘積累不同的大麥基因型為材料，探討鎘吸收和分布的規(guī)律及基因型差異的生理機理;分析不同籽粒鎘積累大麥基因型籽粒蛋白質(zhì)表達(dá)譜差異，鑒定大麥籽粒低鎘積累相關(guān)的目標(biāo)蛋白;克隆籽粒鎘積累相關(guān)基因，并進(jìn)行大麥遺傳轉(zhuǎn)化;構(gòu)建大麥懸浮細(xì)胞系在細(xì)

2、胞水平上分析其耐鎘性差異及鎘積累目標(biāo)基因的表達(dá)情況;以耐鎘和鎘敏感基因型雜交產(chǎn)生F1構(gòu)建的DH群體為材料，構(gòu)建遺傳圖譜，進(jìn)行耐鎘相關(guān)性狀QTL定位及環(huán)境互作研究。同時，探討了外源乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對大麥鎘吸收與耐鎘性影響的基因型差異及生理機制，為低鎘積累育種與生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.鎘脅迫對大麥幼苗光合特性及鎘吸收與分布的影響及基因型差異
　　 以鎘

3、耐性與積累不同的大麥基因型（浙農(nóng)8號和W6nk2）為材料，水培試驗，對照，5、50和500μM不同濃度鎘脅迫試驗，研究了鎘脅迫對大麥幼苗生長、光合特性及鎘吸收與分布的影響及基因型差異。結(jié)果表明，鎘脅迫顯著降低麥苗株高、根長、葉綠素含量、地上部和根系干重;基因型之間差異顯著，耐鎘基因型浙農(nóng)8號受害較輕，鎘敏感基因型W6nk2抑制嚴(yán)重。根尖鎘熒光定位分析結(jié)果顯示，鎘主要滯留在根系的質(zhì)外體，尤其是細(xì)胞壁中，其中耐性基因型更為明顯;同一植株內(nèi)由

4、根尖到莖部的鎘含量呈逐漸下降趨勢，且處理時間越長，鎘積累量越高，并有從根尖向莖部移動的趨勢。鎘脅迫顯著影響大麥的光合作用及葉綠素?zé)晒?，且不同基因型之間差異顯著，鎘敏感基因型W6nk2受抑制嚴(yán)重，耐鎘基因型浙農(nóng)8號表現(xiàn)出相對較強的抗性。
　　 2.不同籽粒鎘積累大麥基因型籽粒蛋白表達(dá)譜的比較研究
　　 利用雙向電泳和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)，分析比較了籽粒鎘積累不同的大麥基因型(浙農(nóng)8號和W6nk2)籽粒蛋白表達(dá)差異，檢

5、測到29個差異表達(dá)蛋白質(zhì)點，浙農(nóng)8號與W6nk2相比，籽粒蛋白質(zhì)高表達(dá)蛋白點17個，表達(dá)受抑制蛋白點12個。差異表達(dá)蛋白以蛋白酶抑制劑類相關(guān)蛋白為主，包括高表達(dá)蛋白α淀粉酶/胰島素抑制劑CM，Z-型絲氨酸蛋白酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑Z7;表達(dá)受抑制蛋白包括胰蛋白酶抑制劑蛋白BTI-CMe2.1蛋白、胰蛋白酶抑制劑蛋白BTI-CMe2.2蛋白和胰蛋白酶抑制劑。其次是熱休克蛋白HSP70和Ras致癌基因家族成員Rab4蛋白等脅迫相關(guān)蛋白

6、在浙農(nóng)8號中高表達(dá);而在W6nk2中有脫氫抗壞血酸還原酶等脅迫相關(guān)蛋白高表達(dá)。另外還有貯藏類蛋白，比如球蛋白，推定的燕麥蛋白前體在浙農(nóng)8號中高表達(dá)。這些差異表達(dá)蛋白可能與大麥籽粒鎘積累與耐性密切相關(guān)，本研究鑒定得到的蛋白可為深入闡明大麥鎘積累機理提供新的契機。
　　 3.大麥遺傳圖譜的構(gòu)建及苗期耐鎘相關(guān)性狀的QTL定位
　　 以萎縮不知（耐鎘）和蘇引麥2號（鎘敏感）雜交F1構(gòu)建的含有108個株系的大麥DH群體為材料，利用

7、SSR和SNP標(biāo)記，構(gòu)建遺傳圖譜，該圖譜包含41個SSR標(biāo)記和15個SNP標(biāo)記，圖譜總長396.9 cM，標(biāo)記間平均距離8.1 cM。水培鎘脅迫試驗，以不加鎘為對照，分析苗期耐鎘相關(guān)農(nóng)藝與生理性狀的耐鎘指數(shù)CTI，檢測到農(nóng)藝性狀相關(guān)加性QTLs9個，表型貢獻(xiàn)率介于3.30-9.49％之間;檢測到酶活和MDA含量相關(guān)QTL22個，分布在大麥7條染色體上，其加性效應(yīng)都達(dá)到了顯著水平。其中地上部和根系各有11個QTLs，平均表型變異為5.6％

8、。另外，檢測到一對控制根系GPX活性的上位性QTL。在第2染色體上標(biāo)記區(qū)間ABC2-Chitinase檢測到了4個QTLs，其中單株葉片數(shù)、根系CAT活性及根系干重都位于0.0cM處，推測為同一QTL，說明控制這些性狀的基因很有可能與ABC轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)。基因與環(huán)境互作條件下，檢測到苗期鎘含量相關(guān)QTLs6個;其中，地上部檢測到了2個，分別位于2H和7H上，且這2個QTLs存在極顯著地加性×加性上位性互作效應(yīng)，加性效應(yīng)值為-23.68，環(huán)

9、境鎘效應(yīng)引起的加性效應(yīng)值為-21.21，可解釋表型變異0.57％。根系檢測到4個，分別位于1H、5H、6H和7H上。地上部和根系分別檢測到7個和11個微量元素含量相關(guān)QTLs，總遺傳貢獻(xiàn)率分別為16.37％和24.95％，由于環(huán)境互作效應(yīng)引起的總遺傳變異分別為12.41％和14.6％。
　　 4.大麥不同生育期耐鎘及鎘積累相關(guān)性狀QTL定位
　　 盆栽試驗，研究了鎘脅迫對不同生育期大麥生長及生理性狀的影響及株系間差異，檢

10、測大麥不同生育期耐鎘與鎘積累相關(guān)QYLs。檢測到不同生育期鎘含量相關(guān)QTLs11個，檢測到2對上位性QTLs，分別控制籽粒鎘積累及根系Zn含量。另外，檢測到地上部鎘累積量相關(guān)的具有顯著加性與環(huán)境互作效應(yīng)的QTL1個。檢測到63個與微量元素含量相關(guān)QTLs，其中苗期、分蘗期、拔節(jié)期和灌漿期4個生育期葉片微量元素含量相關(guān)QTLs25個，收獲期不同器官微量元素相關(guān)QTLs38個;其中17個具有顯著地加性與環(huán)境互作效應(yīng)。定位到了8個與農(nóng)藝和產(chǎn)量

11、CTI相關(guān)的QTLs，表型變異在1.54-10.79％之間。而且，遺傳標(biāo)記區(qū)間EBmac0615-EBmatc0054，EBmac0557-EBmac0615和SNP標(biāo)記ABC轉(zhuǎn)運蛋白檢測到了鎘及數(shù)個微量元素含量相關(guān)QTLs。
　　 5.大麥籽粒鎘積累相關(guān)基因表達(dá)分析、克隆及大麥轉(zhuǎn)化
　　 利用基因芯片技術(shù)，分析了籽粒鎘積累差異顯著的大麥基因型(高積累:浙農(nóng)8號;低積累:W6nk2)幼苗在鎘脅迫下的基因表達(dá)譜，結(jié)果顯示，

12、鎘脅迫顯著影響大麥轉(zhuǎn)錄水平，基因型間存在顯著差異;對2基因型鎘脅迫下差異表達(dá)基因比對發(fā)現(xiàn)，5μMCd處理誘導(dǎo)低鎘積累基因型W6nk2的運輸載體相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，如ZIP、ABC轉(zhuǎn)運蛋白、ATPase、以及Zn、Fe離子運輸載體等基因上調(diào)表達(dá)，說明W6nk2籽粒鎘低積累特性可能與這些轉(zhuǎn)運載體基因的上調(diào)表達(dá)相關(guān);熒光定量PCR驗證這些候選基因，得到了一致的表達(dá)。進(jìn)一步利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建了ZIP基因家族在大麥里發(fā)現(xiàn)的4個成員ZIP

13、3、ZIP5、ZIP7和ZIP8的基因沉默表達(dá)載體，陽性克隆載體經(jīng)PCR驗證、酶切和測序鑒定;為了進(jìn)一步研究ZIP家族不同成員之間及在不同大麥基因型間的表達(dá)差異和功能，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化此基因到品質(zhì)較好的模式轉(zhuǎn)化大麥Goldenpromise，以期進(jìn)一步研究ZIP基因?qū)Υ篼滄k轉(zhuǎn)運與積累的調(diào)控與影響。
　　 6.不同大麥基因型懸浮細(xì)胞系的建立及耐鎘性差異分析
　　 以籽粒鎘積累不同的大麥基因型(高積累:浙農(nóng)8號;低積累:W

14、6nk2)，和耐鎘性不同的大麥基因型(耐鎘:萎縮不知;鎘敏感:東17)為材料，在成功建立分散均勻、穩(wěn)定的胚性懸浮細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，分析鎘脅迫對大麥懸浮細(xì)胞生長影響及其基因型差異，及鎘脅迫對不同基因型大麥懸浮細(xì)胞系生長的影響;并進(jìn)一步利用大麥不同基因型單細(xì)胞懸浮系來驗證本實驗前期結(jié)果所得基因ZIP蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，以直徑約2mm的幼胚為外植體，可以成功建立上述4基因型大麥懸浮細(xì)胞系;50μM Cd處理，4基因型大麥懸浮細(xì)胞活力都顯著

15、下降，隨著Cd處理時間延長，大麥細(xì)胞活力逐步下降;且敏感基因型下降更為明顯。SDS-PAGE電泳和Western雜交結(jié)果表明，ZIP7蛋白在籽粒低鎘積累基因型W6nk2中的表達(dá)要強于浙農(nóng)8號，這一結(jié)果與前面實驗結(jié)果相符。
　　 7.外源NAC對大麥鎘毒害的緩解效應(yīng)及基因型差異
　　 以耐鎘基因型萎縮不知和鎘敏感基因型東17為材料，水培試驗，研究外源NAC對鎘所致大麥損傷的緩解作用。結(jié)果表明，50μM Cd處理下，添加20

16、0μM NAC(Cd+NAC)顯著減少大麥幼苗對鎘的吸收和積累;緩解大麥幼苗鎘毒害癥狀，2個基因型株高、根長及生物量都比Cd處理顯著提高。外源NAC顯著影響細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及活性氧代謝，NAC顯著緩解鎘脅迫引起的葉綠體和根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，基本恢復(fù)葉綠體片層結(jié)構(gòu)的損傷，嗜鋨粒數(shù)量顯著減少，有效提高了根系分生組織細(xì)胞核膜的穩(wěn)定性和完整性。外源NAC對鎘脅迫引起的大麥氧化損傷有明顯的緩解效應(yīng)，顯著提高抗氧化酶活性，減少葉片O2(-)和·OH、M