大麥耐鎘及鎘積累相關QTL定位與候選基因篩選及調控研究.pdf

1、鎘是一種有毒重金屬，其在環(huán)境中的遷移性強，極易被植物吸收積累，并通過食物鏈危害人體健康。明確大麥耐鎘與鎘積累機理是培育耐鎘與低鎘積累新品種和制訂耐鎘與低鎘積累調控措施的基礎。本研究以本實驗室前期篩選獲得的鎘耐性與鎘積累不同的大麥基因型為材料，探討鎘吸收和分布的規(guī)律及基因型差異的生理機理;分析不同籽粒鎘積累大麥基因型籽粒蛋白質表達譜差異，鑒定大麥籽粒低鎘積累相關的目標蛋白;克隆籽粒鎘積累相關基因，并進行大麥遺傳轉化;構建大麥懸浮細胞系在細

2、胞水平上分析其耐鎘性差異及鎘積累目標基因的表達情況;以耐鎘和鎘敏感基因型雜交產生F1構建的DH群體為材料，構建遺傳圖譜，進行耐鎘相關性狀QTL定位及環(huán)境互作研究。同時，探討了外源乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對大麥鎘吸收與耐鎘性影響的基因型差異及生理機制，為低鎘積累育種與生產提供理論依據和技術指導。主要研究結果如下:
　　 1.鎘脅迫對大麥幼苗光合特性及鎘吸收與分布的影響及基因型差異
　　 以鎘

3、耐性與積累不同的大麥基因型（浙農8號和W6nk2）為材料，水培試驗，對照，5、50和500μM不同濃度鎘脅迫試驗，研究了鎘脅迫對大麥幼苗生長、光合特性及鎘吸收與分布的影響及基因型差異。結果表明，鎘脅迫顯著降低麥苗株高、根長、葉綠素含量、地上部和根系干重;基因型之間差異顯著，耐鎘基因型浙農8號受害較輕，鎘敏感基因型W6nk2抑制嚴重。根尖鎘熒光定位分析結果顯示，鎘主要滯留在根系的質外體，尤其是細胞壁中，其中耐性基因型更為明顯;同一植株內由

4、根尖到莖部的鎘含量呈逐漸下降趨勢，且處理時間越長，鎘積累量越高，并有從根尖向莖部移動的趨勢。鎘脅迫顯著影響大麥的光合作用及葉綠素熒光，且不同基因型之間差異顯著，鎘敏感基因型W6nk2受抑制嚴重，耐鎘基因型浙農8號表現出相對較強的抗性。
　　 2.不同籽粒鎘積累大麥基因型籽粒蛋白表達譜的比較研究
　　 利用雙向電泳和MALDI-TOF質譜技術，分析比較了籽粒鎘積累不同的大麥基因型(浙農8號和W6nk2)籽粒蛋白表達差異，檢

5、測到29個差異表達蛋白質點，浙農8號與W6nk2相比，籽粒蛋白質高表達蛋白點17個，表達受抑制蛋白點12個。差異表達蛋白以蛋白酶抑制劑類相關蛋白為主，包括高表達蛋白α淀粉酶/胰島素抑制劑CM，Z-型絲氨酸蛋白酶抑制劑和絲氨酸蛋白酶抑制劑Z7;表達受抑制蛋白包括胰蛋白酶抑制劑蛋白BTI-CMe2.1蛋白、胰蛋白酶抑制劑蛋白BTI-CMe2.2蛋白和胰蛋白酶抑制劑。其次是熱休克蛋白HSP70和Ras致癌基因家族成員Rab4蛋白等脅迫相關蛋白

6、在浙農8號中高表達;而在W6nk2中有脫氫抗壞血酸還原酶等脅迫相關蛋白高表達。另外還有貯藏類蛋白，比如球蛋白，推定的燕麥蛋白前體在浙農8號中高表達。這些差異表達蛋白可能與大麥籽粒鎘積累與耐性密切相關，本研究鑒定得到的蛋白可為深入闡明大麥鎘積累機理提供新的契機。
　　 3.大麥遺傳圖譜的構建及苗期耐鎘相關性狀的QTL定位
　　 以萎縮不知（耐鎘）和蘇引麥2號（鎘敏感）雜交F1構建的含有108個株系的大麥DH群體為材料，利用

7、SSR和SNP標記，構建遺傳圖譜，該圖譜包含41個SSR標記和15個SNP標記，圖譜總長396.9 cM，標記間平均距離8.1 cM。水培鎘脅迫試驗，以不加鎘為對照，分析苗期耐鎘相關農藝與生理性狀的耐鎘指數CTI，檢測到農藝性狀相關加性QTLs9個，表型貢獻率介于3.30-9.49％之間;檢測到酶活和MDA含量相關QTL22個，分布在大麥7條染色體上，其加性效應都達到了顯著水平。其中地上部和根系各有11個QTLs，平均表型變異為5.6％

8、。另外，檢測到一對控制根系GPX活性的上位性QTL。在第2染色體上標記區(qū)間ABC2-Chitinase檢測到了4個QTLs，其中單株葉片數、根系CAT活性及根系干重都位于0.0cM處，推測為同一QTL，說明控制這些性狀的基因很有可能與ABC轉運蛋白相關?；蚺c環(huán)境互作條件下，檢測到苗期鎘含量相關QTLs6個;其中，地上部檢測到了2個，分別位于2H和7H上，且這2個QTLs存在極顯著地加性×加性上位性互作效應，加性效應值為-23.68，環(huán)

9、境鎘效應引起的加性效應值為-21.21，可解釋表型變異0.57％。根系檢測到4個，分別位于1H、5H、6H和7H上。地上部和根系分別檢測到7個和11個微量元素含量相關QTLs，總遺傳貢獻率分別為16.37％和24.95％，由于環(huán)境互作效應引起的總遺傳變異分別為12.41％和14.6％。
　　 4.大麥不同生育期耐鎘及鎘積累相關性狀QTL定位
　　 盆栽試驗，研究了鎘脅迫對不同生育期大麥生長及生理性狀的影響及株系間差異，檢

10、測大麥不同生育期耐鎘與鎘積累相關QYLs。檢測到不同生育期鎘含量相關QTLs11個，檢測到2對上位性QTLs，分別控制籽粒鎘積累及根系Zn含量。另外，檢測到地上部鎘累積量相關的具有顯著加性與環(huán)境互作效應的QTL1個。檢測到63個與微量元素含量相關QTLs，其中苗期、分蘗期、拔節(jié)期和灌漿期4個生育期葉片微量元素含量相關QTLs25個，收獲期不同器官微量元素相關QTLs38個;其中17個具有顯著地加性與環(huán)境互作效應。定位到了8個與農藝和產量

11、CTI相關的QTLs，表型變異在1.54-10.79％之間。而且，遺傳標記區(qū)間EBmac0615-EBmatc0054，EBmac0557-EBmac0615和SNP標記ABC轉運蛋白檢測到了鎘及數個微量元素含量相關QTLs。
　　 5.大麥籽粒鎘積累相關基因表達分析、克隆及大麥轉化
　　 利用基因芯片技術，分析了籽粒鎘積累差異顯著的大麥基因型(高積累:浙農8號;低積累:W6nk2)幼苗在鎘脅迫下的基因表達譜，結果顯示，

12、鎘脅迫顯著影響大麥轉錄水平，基因型間存在顯著差異;對2基因型鎘脅迫下差異表達基因比對發(fā)現，5μMCd處理誘導低鎘積累基因型W6nk2的運輸載體相關基因上調表達，如ZIP、ABC轉運蛋白、ATPase、以及Zn、Fe離子運輸載體等基因上調表達，說明W6nk2籽粒鎘低積累特性可能與這些轉運載體基因的上調表達相關;熒光定量PCR驗證這些候選基因，得到了一致的表達。進一步利用Gateway克隆技術構建了ZIP基因家族在大麥里發(fā)現的4個成員ZIP

13、3、ZIP5、ZIP7和ZIP8的基因沉默表達載體，陽性克隆載體經PCR驗證、酶切和測序鑒定;為了進一步研究ZIP家族不同成員之間及在不同大麥基因型間的表達差異和功能，用農桿菌介導法轉化此基因到品質較好的模式轉化大麥Goldenpromise，以期進一步研究ZIP基因對大麥鎘轉運與積累的調控與影響。
　　 6.不同大麥基因型懸浮細胞系的建立及耐鎘性差異分析
　　 以籽粒鎘積累不同的大麥基因型(高積累:浙農8號;低積累:W

14、6nk2)，和耐鎘性不同的大麥基因型(耐鎘:萎縮不知;鎘敏感:東17)為材料，在成功建立分散均勻、穩(wěn)定的胚性懸浮細胞系的基礎上，分析鎘脅迫對大麥懸浮細胞生長影響及其基因型差異，及鎘脅迫對不同基因型大麥懸浮細胞系生長的影響;并進一步利用大麥不同基因型單細胞懸浮系來驗證本實驗前期結果所得基因ZIP蛋白的表達情況。結果表明，以直徑約2mm的幼胚為外植體，可以成功建立上述4基因型大麥懸浮細胞系;50μM Cd處理，4基因型大麥懸浮細胞活力都顯著

15、下降，隨著Cd處理時間延長，大麥細胞活力逐步下降;且敏感基因型下降更為明顯。SDS-PAGE電泳和Western雜交結果表明，ZIP7蛋白在籽粒低鎘積累基因型W6nk2中的表達要強于浙農8號，這一結果與前面實驗結果相符。
　　 7.外源NAC對大麥鎘毒害的緩解效應及基因型差異
　　 以耐鎘基因型萎縮不知和鎘敏感基因型東17為材料，水培試驗，研究外源NAC對鎘所致大麥損傷的緩解作用。結果表明，50μM Cd處理下，添加20

16、0μM NAC(Cd+NAC)顯著減少大麥幼苗對鎘的吸收和積累;緩解大麥幼苗鎘毒害癥狀，2個基因型株高、根長及生物量都比Cd處理顯著提高。外源NAC顯著影響細胞超微結構及活性氧代謝，NAC顯著緩解鎘脅迫引起的葉綠體和根系細胞結構的損傷，基本恢復葉綠體片層結構的損傷，嗜鋨粒數量顯著減少，有效提高了根系分生組織細胞核膜的穩(wěn)定性和完整性。外源NAC對鎘脅迫引起的大麥氧化損傷有明顯的緩解效應，顯著提高抗氧化酶活性，減少葉片O2(-)和·OH、M