五行湯抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]“五行湯”由牛蒡、白蘿卜、胡蘿卜、干香菇和干白蘿卜葉配制而成,民間服用有一定的抗腫瘤效果,值得深入研究。在大力發(fā)展傳統(tǒng)醫(yī)藥的今天,本課題結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)觀察研究五行湯的抗癌效果及其機(jī)制。
　　 [方法]1、不同批次五行湯穩(wěn)定性鑒定:紫外-可見光吸收光譜分析和成分定性檢測(cè),比較不同產(chǎn)地和不同貯存時(shí)間的五行湯組分相似度;不同批次五行湯處理腫瘤細(xì)胞,設(shè)立濃度梯度,MTT法檢測(cè)比較抑瘤作用。2、五行湯促腫瘤細(xì)胞SGC-79

2、01死亡方式檢測(cè):熒光染色和電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法檢測(cè)凋亡率。3、五行湯促SGC-7901細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的探究:蛋白印跡檢測(cè)凋亡途徑蛋白變化;鈣離子特異性熒光探針檢測(cè)胞漿鈣離子濃度變化;吖啶橙染色檢測(cè)溶酶體膜完整性;AnnexinV結(jié)合實(shí)驗(yàn)和CCK-8法檢測(cè)不同抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡和存活的影響。
　　 [結(jié)果]選取不同產(chǎn)地原料,在不同時(shí)間按標(biāo)準(zhǔn)流程配制不同批次五行湯;紫外-可見光吸收光譜顯示

3、不同批次五行湯吸收峰波形相似。不同批次五行湯主要成分定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致:蛋白質(zhì)、酚類、黃酮檢測(cè)均為陽性、生物堿檢測(cè)均為陰性。不同批次五行湯均可抑制腫瘤細(xì)胞SGC-7901生長(zhǎng),且抑制作用接近。PI熒光染色和電鏡觀察到五行湯處理的SGC-7901細(xì)胞呈凋亡特征;AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)流式檢測(cè)到五行湯促SGC-7901細(xì)胞凋亡作用。免疫印跡檢測(cè)半胱天冬氨酸酶(caspase)家族蛋白無活化跡象;AnnexinV結(jié)合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到廣譜

4、caspase抑制劑對(duì)細(xì)胞凋亡沒有影響。熒光探針檢測(cè)到胞漿鈣離子濃度升高;胞內(nèi)鈣離子拮抗劑BaptaAM可以明顯降低五行湯誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞凋亡(P＜0.05),且對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用呈濃度依賴性。吖啶橙(AO)染色觀察到溶酶體膜滲漏;胞漿蛋白免疫印跡檢測(cè)到溶酶體釋放蛋白酶cathepsinD和cathepsinB至胞漿;天冬氨酸蛋白酶cathepsinD抑制劑對(duì)五行湯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡沒有影響;半胱氨酸蛋白酶cathepsinB、L、S

5、抑制劑可以明顯減少細(xì)胞凋亡(P＜0.05),且對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用呈濃度依賴性。胞內(nèi)鈣離子拮抗劑BaptaAM可以減少溶酶體膜滲漏。JC-1染色檢測(cè)出線粒體膜電位降低;胞漿蛋白免疫印跡發(fā)現(xiàn)線粒體沒有釋放細(xì)胞色素C(cytoC)而選擇性釋放凋亡誘導(dǎo)因子(AIF);核蛋白免疫印跡顯示AIF沒有入核;AIF抑制劑和鈣蛋白酶calpain抑制劑均對(duì)五行湯誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞凋亡沒有保護(hù)作用。
　　 [結(jié)論]一定范圍內(nèi)的不同批次五行湯組