志賀氏菌分離、檢測及其在不同環(huán)境條件下生長特性研究.pdf

1、本文首先對志賀氏菌的微生物學(xué)特性及其致病性作了簡要介紹,同時對于國內(nèi)外近來志賀氏菌導(dǎo)致的食物中毒數(shù)據(jù)進(jìn)行了收集。由于近年來志賀氏菌污染食品導(dǎo)致的安全事件時有發(fā)生,因此對于我國國內(nèi)流行志賀氏菌菌株的生長環(huán)境、生長特性、生長規(guī)律研究,顯得的尤為重要。
　　 志賀氏菌(shigella),無芽孢、無鞭毛、無菌膜、為革蘭氏陰性菌桿菌,具有腸桿菌科的基本特性,在我國感染性腹瀉病原菌中居首位,志賀氏菌感染而引起的細(xì)菌性痢疾是危害人民健康最嚴(yán)

2、重的傳染病之一。志賀氏菌是細(xì)菌性食物中毒中常見的致病菌,即可以通過水,也可在熟食或生的食品上繁殖,傳播腹瀉及痢疾等疾病。志賀氏菌食物中毒在夏秋季易于發(fā)生,若食入被大量活菌污染的食品即可引起食物中毒。
　　 首先從病患糞便中提取志賀氏菌,采用選擇性培養(yǎng)基、志賀氏菌多價(jià)血清凝集、基礎(chǔ)生化反應(yīng)、革蘭氏染色鏡鑒、群、型血清凝集、補(bǔ)充生化反應(yīng)來分離糞便中的志賀氏菌,經(jīng)過初步鑒定得知分離出的志賀氏菌為福氏F2b型。隨后,研究在溫度、pH、鹽

3、度3個因素交互作用下食源性致病微生物福氏志賀氏菌F2b的最優(yōu)培養(yǎng)條件。在溫度、pH、鹽度單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box—Behnken中心組合試驗(yàn)原理,設(shè)計(jì)三因素交互作用試驗(yàn)。以溫度、pH、鹽度為響應(yīng)因子,以菌液的0D550為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面法處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明在所選的因素水平范圍內(nèi),溫度、pH對F2b生長影響顯著,溫度、pH值之間交互作用顯著。獲得志賀氏菌F2b的最佳生長條件為溫度35.8℃,pH值7.7,鹽度0.76％。經(jīng)過驗(yàn)

4、證,實(shí)測值和預(yù)測值之間偏差為1.1％,表明響應(yīng)面法優(yōu)化F2b培養(yǎng)條件真實(shí)快速有效。
　　 在確定志賀氏菌在溫度、pH、鹽度影響下的生長規(guī)律后確定了該菌的最適生長條件。隨后建立了在pH、鹽度最佳情況下志賀氏菌兩個血清型F2b和宋內(nèi)氏菌的溫度生長預(yù)測模型。分別建立了一級預(yù)測模型和二級預(yù)測模型。一級模型運(yùn)用Gompertz方程和Linear方程擬合志賀氏菌的生長曲線。二級模型是根據(jù)由一級模型確定的最大比生長速率μm的值,利用平方根模型

5、的擴(kuò)展式進(jìn)行擬合,分別得到溫度預(yù)測模型。根據(jù)溫度預(yù)測模型,得出志賀氏菌F2b的最低生長溫度Tmin為15.8℃,最高生長溫度Tmax為49.6℃；宋內(nèi)氏志賀氏菌的最低生長溫度Tmin為16.8℃,最高生長溫度Tmax為49.5℃。對預(yù)測模型分別進(jìn)行驗(yàn)證,預(yù)測值和實(shí)測值的殘差基本都在±0.5范圍內(nèi),驗(yàn)證結(jié)果表明模型是可靠的,可以作為食品志賀氏菌安全性評價(jià)的定量依據(jù)。以此模型為依據(jù),在已知食品中初始菌落的前提下,我們可以預(yù)測出在任意溫度下志

6、賀氏菌的數(shù)量,對食品中致病微生物志賀氏菌的生長起到預(yù)測和監(jiān)控的作用。
　　 在基本了解志賀氏菌的生長規(guī)律的前提下,我們根據(jù)福氏志賀菌侵襲性質(zhì)粒抗原H基因(invasion plasmid antigen H,ipaH),建立了PCR檢測志賀氏菌的初步方法。設(shè)計(jì)了一對特異性引物,預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增的目的基因片段為435bp。PCR反應(yīng)體系確定為20μl；擴(kuò)增目的DNA只需要2h,此外對于PCR體系的特異性進(jìn)行了分析,最終建立了快速檢測