環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)志賀氏菌的研究.pdf

1、志賀氏菌（Shigella）是引起食物中毒的常見致病菌之一，引起食物中毒的食品多為肉類，乳制品等蛋白質(zhì)含量多的食品。目前，國(guó)內(nèi)檢測(cè)食品中志賀氏菌仍采用傳統(tǒng)的方法，其操作繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，通常需要3～5 d。本研究建立了一套用LAMP技術(shù)快速檢測(cè)志賀氏菌的方法，縮短了檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)方法的靈敏性。
　　 FTA卡是用螯合劑和變性劑浸泡過的纖維基質(zhì)，他可以在接觸微生物時(shí)將其吸附并裂解細(xì)胞，使DNA吸附在纖維基質(zhì)上。FTA可以高效、

2、快速、低損耗的提取DNA。本研究將FTA與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）方法相結(jié)合，檢測(cè)志賀氏菌。
　　 本研究針對(duì)志賀氏菌的特異基因ipaH設(shè)計(jì)引物，用LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，對(duì)內(nèi)引物濃度、外引物濃度、Mg2+濃度、Bst酶濃度等反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立LAMP反應(yīng)體系。
　　 LAMP反應(yīng)體系如下：F3與B3（LAMP反應(yīng)外引物）各0.2 mM；BIP與FIP(LAMP反應(yīng)內(nèi)引物）0.8 mM;其它反應(yīng)組分終濃

3、度分別為：0.3 mM dNTP，0.3 mM MgCl2,2.5 μL ThermoPol buffer（20 mMTris-HCl(pH8.8,25℃），10 mM KCl，10 mM(NH4）2SO4,2 mM MgSO4，0.1％1.Triton X-100），0.5 μL(8U)Bst大分子聚合酶，1 μL 目標(biāo)DNA，純水補(bǔ)足體積到25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為62℃保存1 h,80 2 ℃ min使酶滅活。
　　 本研

4、究通過LAMP方法檢測(cè)純菌液及人工污染豬肉對(duì)LAMP反應(yīng)的最小檢出限進(jìn)行確定。結(jié)果表明：LAMP在反應(yīng)過程中，能夠產(chǎn)生大量的肉眼可見的焦磷酸鎂沉淀。LAMP對(duì)菌懸液的最低檢出濃度為62 CFU/mL，傳統(tǒng)的PCR方法對(duì)菌懸液的最低檢出濃度620 CFU/mL。LAMP對(duì)豬肉中志賀氏菌的最低檢出量為42 CFU/mL。LAMP法擴(kuò)增最短可在20min內(nèi)完成，對(duì)豬肉中志賀氏菌的檢測(cè)的整個(gè)檢測(cè)過程（包括DNA提取1 h、LAMP反應(yīng)30 mi